Питательные среды, Культивирование микро- организмов

При приготовлении больших количеств  агара (более 10 л) можно пользоваться другим способом его варки: кастрюлю с агар-агаром на любой питательной основе помещают в автоклав под текучий пар (100°) на 1 час. Текучим паром можно варить агар также в текучепаровом аппарате. Затем оставляют для медленного и равномерного отстаивания в теплом месте (можно оставить в автоклаве с потушенной горелкой) на 1 час, после чего проверяют реакцию, исправляют ее и фильтруют.

Можно после отстаивания дать агару застыть и на другой день срезать и удалить нижнюю его часть с осадком. Прозрачный слой измельчают ножом и расплавляют текучим паром при 100° (1—11/2 часа), после чего устанавливают реакцию и фильтруют. Если после расплавления срезанного агара в нем будет заметна муть, дают ему вновь отстояться в теплом месте, после чего осторожно сливают с осадка. Надо избегать подщелачивания готового агара, так как не исключена возможность выпадения осадка после подщелачивания при последующей стерилизации.

Прозрачный и светлый агар получают также путем просветления его яичным белком или кровяной сывороткой. На каждые 1—2 л агара, остуженного до 50°, прибавляют белок одного куриного яйца или 25—50 мл кровяной сыворотки. Яичный белок нужно предварительно хорошо размешать с двойным объемом холодной воды. Употребляют только свежие яйца, в противном случае агар может сделаться еще более мутным.

После прибавления белка или  сыворотки агар тщательно размешивают и кипятят 10-15 минут на огне. Добавленный белок свертывается и адсорбирует взвешенные частицы. Крупно хлопчатый осадок легко отделяется фильтрованием.

Фильтрованный агар разливают в посуду, стерилизуют в автоклаве под давлением 1 атм. в течение 30 минут. После стерилизации питательный агар, разлитый в пробирки, оставляют застыть столбиком, если он приготовлен не для немедленного использования, или скашивают (косой агар) для непосредственного употребления. Для скашивания пробирки с горячим агаром укладывают на покатой поверхности или под верхнюю часть пробирок подкладывают резиновую или стеклянную трубку. После остывания на агаровой среде собирается конденсационная жидкость, которая сохраняется некоторое время, если среду хранить в прохладном месте.

Рост микробов на влажном агаре лучше, чем на сухом. Последний следует расплавить и дать ему снова застыть, тогда выделится снова конденсационная вода. Однако многократное кипячение агара и особенно стерилизация снижают его плотность.

Для разливки в чашки Петри пользуются агаром из флаконов или пробирок. Непосредственно перед разливкой агар следует растопить в водяной бане или текучепаровом аппарате, а затем остудить до 50—55°. Чашки Петри должны быть стерильны. Срок годности чашек со средой до 48 часов. Хранить их следует на холоду.

 

8.Посуда.

Питательные среды готовят в  кастрюлях, эмалированных или из нержавеющей стали. Готовые питательные  среды разливают во флаконы, пробирки, чашки.

Новую стеклянную посуду кипятят в 1—2% растворе соляной кислоты для  нейтрализации растворимой щелочи, затем тщательно промывают в  проточной воде и сушат. Посуду, бывшую в употреблении, стерилизуют, затем  моют, прополаскивают и сушат. Сухие  флаконы, колбы, пробирки закрывают  ватно-марлевыми пробками.

 

9.Способы получения питательных  сред.

 

Мясная вода: Получение – 100 г  свежей говядины или телятины освобождают  от костей,жира и сухожилий,пропускают через мясорубку,фарш заливают 1 литром водопроводной воды,хорошо размешивают.Оставляют на сутки в прохладном месте или помещают на 2 часа в термостат.

Мясную пасту отжимают через  марлю, кипятят в течение 5 минут. Для свертывания белков дают остыть.Фильтруют черех ватный фильтр,доливают водой до первоночального объема.Мясную воду разливают во флаконы,стерелизут 20-30 минут при 120 градусов и сохраняют в темном месте . Она имеет вид прозрачной желтоватой жидкости слабокислой реакции (pH 6.2-6.4), без белков. В мясной воде содержится небольшое количество аминокислот,солей,углеводов,факторов роста и экстрактивных веществ. Для приготовления обычных питательных сред к мясной воде прибавляют сухой пептон,который является  первичным продуктом гидролиза белка и состоит из смеси полипептидов и аминокислот,полученных путем пептического или триптического переваривания.

На мясокомбинатах для производства сухого пептона используют фибрин,кровь и другие отходы. Сушат пептон в распылительной вакуум-сушилке.

Жидкий пептон можно приготовить  в лабораторных условиях путем пептического переваривания белков.

Перевар Хоттингера  - Мясо, освобожденное от жира и сухожилий, нарезают небольшими кусочками, помещают в кастрюлю с кипящей водопроводной водой (в полуторном объеме) и кипятят 15—20 минут, затем мясо извлекают из жидкости и пропускают через мясорубку. Установив рН охлажденной до 40—45°С жидкости, равный 8, заливают ею фарш. К полученной смеси добавляют сухой панкреатин в количестве 0,5—1% или поджелудочную железу из расчета 100 г железы на 1 л жидкости. Затем смесь снова подщелачивают до рН 8 и разливают ее в бутыль. Туда же добавляют 2—3% хлороформа и, закрыв бутыль резиновой пробкой, несколько раз встряхивают содержимое. Бутыль ставят на 7—14 суток при температуре 37°С.

В результате переваривания мясной фарш превращается в гомогенный сероватый  осадок, над которым находится  совершенно прозрачная жидкость соломенно-желтого  цвета. Перевар Хоттингера хорошего качества дает положительную реакцию на триптофан и содержит 560—860 мг% аминного азота. Для приготовления бульона к 1 части перевара прибавляют 6—7 частей воды.

 Мясо-пептонный бульон (МПБ).   В 1 л мясной воды растворяют при подогревании и помешивании 10 г пептона (1%) и 5 г (0,5%) хлористого натрия. Рекомендуется брать 3 части хлористого натрия и 2 части двузамещенного фосфорнокислого натрия. Смесь вводится в количестве 0,5%. Фосфорнокислый натрий стабилизирует реакцию среды и служит дополнительным источником фосфора. Устанавливают рН среды до 7,6—7,8, кипятят 30—45 минут до выпадения осадка.

2.       Охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр, доливают водой до первоначального объема, проверяют рН.

3.       Разливают по пробиркам, флаконам и стерилизуют 15— 20 минут в автоклаве при 120°С.

Концентрированный мясо-пептонный бульон готовят на особой мясной воде (1 кг мяса заливают 1 л воды). Такой бульон служит для выращивания анаэробных и других микробов.

 

Мясо–пептонный агар (МПА): К мясо-пептонному бульону для придания плотности добавляют 2—2,5% мелко нарезанного и промытого агар-агара.

Агар-агар получают путем специальной  обработки морских водорослей. Он является веществом полисахаридной природы, содержит незначительное количество азота и не представляет собой  питательный субстрат. Студень, образуемый агар-агаром, расплавляется при 70— 100°C и застывает при 40—50°.

2.       Кипятят, помешивая, до полного расплавления агара. В некоторых случаях для просветления среды прибавляют белок одного куриного яйца, смешанного с двойным количеством холодной воды. Среду помещают в автоклав на 45 минут при 115°С. Свернувшиеся хлопья белка адсорбируют взвешенные частицы и осаждаются на дно.

3.       Проверяют и исправляют реакцию среды. Отстаивают и фильтруют через ватно-марлевый фильтр в горячем автоклаве или в специальной металлической воронке с двойными стенками, между которыми находится горячая вода.

4.       Разливают среду через стеклянную воронку с зажимом в пробирки и флаконы и стерилизуют в автоклаве при 120°С в течение 15—20 минут.

5.       Из расплавленного стерильного мясо-пептонного агара приготовляют скошенный и прямой агар (агар столбиком). В первом случае пробирки укладывают горизонтально до полного застывания, во втором — пробирки помещают в штатив вертикально.

В настоящее время бактериологические лаборатории широко используют сухие  питательные среды в виде порошков, хранящихся в герметически закрытых банках и пакетах.

Кроме обычных питательных сред (МПБ и МПА), имеются специальные  и дифференциально-диагностические  среды. Готовят среды по прописи, указанной на этикетке, навеску порошка  растворяют в определенном объеме дистиллированной воды, среду разливают в пробирки и стерилизуют при соответствующей  температуре. Постоянство состава, стандартность среды, простота и  удобство в работе, легкость транспортировки  и хранения являются большим преимуществом  сухих питательных сред.

Для определения рН плотных питательных  сред их расплавляют. Определяют pH с использованием pH-метров или (менее точно) с помощью индикаторной бумаги.

После установления соответствующего рН среду кипятят, фильтруют, осветляют, разливают во флаконы, пробирки и  стерилизуют. Следует учитывать, что  после стерилизации среда становится более кислой.

 

Мясо-пептонная желатина (МПЖ). К 1 литру МПБ добавляют желатин до конечной концентрации 10-20%, нагревают, устанавливают слабо-щелочную  pH, кипятят, фильтруют, разливают по пробиркам и стерилизуют в кипятильнике Коха текучим паром 3 дня или однократно  автоклавированием при 1200С при 1 атм.  течение 20 мин.

Полужидкий мясо-пептонный агар (ПЖА) готовят, как МПА, но добавляют 0,25% агара, кипятят до его расплавления, устанавливают требуемую pH, фильтруют в горячем виде и стерилизуют автоклавированием.

Бульон Хоттингера: основной перевар Хоттингера разводят водой 1:5 (1:8), добавляют 0,5% NaСI, 0,1 г гидрофосфата калия, устанавливают pH, кипятят 150-20 мин, фильтруют, разливают по емкостям и стерилизуют автоклавированием при 1200 20 мин.

Агар Хоттингера готовят, добавляя к бульону Хоттингера 2% агар-агара.

Питательный бульон содержит: триптический гидролизат кильки –10,05, NaCI- 4,95. 15 г порошка этого бульона растворяют а 1 л дист. Воды, кипятят 2 мин, фильтруют, разливают по емкостям и стерилизуют а автоклаве при 1200С 20 мин (Ph 7,3).

Питательный агар содержит: ферментативный гидролизат кормовых дрожжей – 12 г, агар- 12,5 г; NaCI –5,5 г. Навеску 36 г полученного порошка растворяют в 1 л дист. Н2О, кипятят 3 мин, фильтруют, стерилизуют автоклавированием при1200С 20 мин (pН 7,3).

Б).Обогащенные среды.

Многие виды болезнетворных бактерий плохо растут на обще-употребительных  средах, поэтому в основные среды  добавляют кровь, сыворотку крови, углеводы и т.д. Такие среды получили название обогащенных.

Сывороточный и кровяной агары: к расплавленному и охлажденному стерильному питательному агару добавляют дефибринированной крови или сыворотки крови (лошади, КРС, кролика). Компоненты перемешивают, разливают в чашки Петри, пробирки и оставляют до застывания.

Сывороточный и кровяной бульоны  готовят аналогично.

Растворы углеводов стерилизуют  текучим паром или фильтрованием  и добавляют в количестве 0,5- 1% к пит. среде.

В).Специальные среды.

Среды, разработанные с учетом специфических  ростовых потребностей ряда бактерий.

Среда Мак-Коя: куриные яйца обрабатывают спиртом, проводят через пламя горелки. Стерильно вскрывают, желтки отделяют от белков. К 60 частям желтков добавляют 40 ч физиологического раствора. Компоненты перемешивают и разливают в пробирки и помещают в наклонном положении  в аппарат для свертывания  сыворотки. Стерилизуют.

Среда Терских состоит из фосфатной  смеси Зеренсена и кроличьей сыворотки.

Смесь Зеренсена: раствор А: гидрофосфат натрия, вода дист.; раствор Б: дигидрофосфат калия, вода дист. К 90 мл раствора А добавляют 10 мл раствора Б и доводят объем до 1000 мл, разливают по пробиркам, стерилизуют, а затем добавляют 6-8 капель стерильной инактивированной сыворотки кролика.

Г). Элективные (избирательные) среды

Предназначены для культивирования  определенных групп микроорганизмов, обеспечивающие преимущественное развитие одного вида или группы родственных  микроорганизмов и менее пригодные  или совсем не пригодные для развития других. Их применяют главным образом  для выделения микроорганизмов  из мест их естественного обитания и получения накопительных культур. Элективные среды чрезвычайно разнообразны по своему составу. По консистенции среды  данного типа могут быть плотными и жидкими. Жидкие среды называются средами обогащения или накопления, их применяют, когда ставят цель увеличить  количество искомого микроорганизма смешанной  популяции. Среды стерилизуют автоклавированием текучим паром или в автоклаве под давлением при 1 атм 12-30 мин.

Молочно-солевой агар предназначен для избирательного культивирования стафилококков.

Среда Шустовой предназначена для  выделения сальмонелл

Среды Раппопорта и Мюллера предназначены для культивирования сальмонелл.

Среда Кауфмана – это среда обогащения для сальмонелл

Казеиново - угольный агар (КУА) с пенициллином используют для культивирования бордетелл.

Д). Дифференциально - диагностические  среды.

Предназначены для выявления ферментов  у микроорганизмов. В состав этих сред входит основная питательная среда, обеспечивающая рост изучаемого микроорганизма, субстрат для обнаружения фермента и индикатор, по изменению цвета  которого судят о сдвиге pH среды в результате расщепления субстрата.

Среды Гисса используют для изучения ферментативных свойств выделенных культур микроорганизмов. К 100мл дист. Воды добавляют 1% пептона, 0,5 г NaCI. Компоненты растворяют, фильтруют, устанавливают pH,добавляют один из углеводов субстратов, агар-агар, а затем индикатора Андрэдэ. Готовую среду разливают по 3мл в пробирки, стерилизуют текучим паром 3 дня по 30 мин.

Среда Энда содержит лактозу в качестве субстрата и предназначена для  дифференцировки бактерий, различающихся  по способности расщеплять глюкозу.

Среда Левина, по целевому назначению аналогична среде Эндо, но содержит другой индикатор.

Агар Плоскирева предназначен для выделения сальмонелл, содержит лактозу в качестве субстрата и компоненты, подавляющие рост сопутствующей микрофлоры.