Анализ эфирного масла физико-химическими методами

Навеску измельченного сырья помещают в колбу, приливают 300 мл воды, колбу соединяют с паропроводной трубкой и заполняют водой градуированную и сливную трубки через кран при помощи резиновой трубки, оканчивающейся воронкой. Колбу с содержимым нагревают и кипятят с интенсивностью, при которой скорость стекания дистиллята составляет 60—65 капель в 1 мин в течение времени, указанного в соответствующей нормативной документации на лекарственное растительное сырье. Через 5 мин после окончания перегонки открывают кран, постепенно спуская дистиллят так, чтобы эфирное масла заняло градуированную часть трубки приемника, и еще через 5 мин замеряют объем эфирного масла. Содержание эфирного масла в объемно-весовых процентах (X) в пересчете на абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:

где V — объем эфирного масла в миллилитрах; m — масса сырья в граммах;W — потеря в массе при высушивании сырья в процентах.

 

Метод 3. Для определения эфирного масла методом 3 используют прибор, изображенный на рис. 2. Навеску измельченного сырья помещают в колбу, приливают 300 мл воды, колбу соединяют с паропроводной трубкой и заполняют водой градуированную и сливную трубки через кран при помощи резиновой трубки, оканчивающейся воронкой. Затем через боковую трубку при помощи пипетки вливают в приемник около 0,5 мл декалина и точно замеряют его объем, опуская для этого уровень жидкости в градуированную часть трубки. Далее поступают, как описано в методе 2.

Содержание эфирного масла в объемно-весовых процентах (X) в пересчете на абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:

;

где V— объем раствора масла в декалине в миллилитрах; V1 — объем декалина в миллилитрах; m — масса сырья в граммах; W — потеря в массе при высушивании сырья в процентах.

 

Метод 4. Для определения эфирного масла методом 4 используют прибор, изображенный на рис. 3.

 

Прибор состоит из круглодонной колбы с коротким горлом А вместимостью 1000 мл, паропроводной трубки Б, холодильника В, отстойника Г с термометром до 100°С Д, ртутный шарик которого находится на уровне отверстия холодильника, градуированной трубки Е с ценой деления 0,001 мл, спускного крана Ж и сливной трубки З. Для заполнения прибора водой используется резиновая трубка И с внутренним диаметром 4,5—5 мм, длиной 450 мм и воронка К диаметром 30—40 мм. Перед каждым определением через прибор пропускают пар в течение 15—20 мин. После 6—8 определений прибор последовательно промывают ацетоном и водой.

Навеску измельченного сырья помещают в колбу, прибавляют необходимое количество воды. Колбу соединяют с паропроводной трубкой и заполняют водой градуированную и сливную трубки через кран при помощи резиновой трубки, оканчивающейся воронкой, до тех пор, пока в нижней воронкообразной части отстойника не наберется слой воды высотой 8—12 мм. Во время перегонки этот уровень воды должен оставаться без изменения. Колбу с содержимым нагревают и кипятят в течение времени, указанного в нормативной документации на лекарственное растительное сырье. Во время перегонки температура в отстойнике не должна превышать 25°С. Через 5 мин после окончания перегонки открывают кран, постепенно спуская дистиллят так, чтобы эфирное масло заняло градуированную часть трубки. Еще через 5 мин замеряют объем эфирного масла. Содержание эфирного масла в объемно-весовых процентах (X) в пересчете на абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:

;

где V — объем эфирного масла в миллилитрах,

m — масса сырья в  граммах;

W — потеря в массе  при высушивании сырья в процентах

 

 

 2.2.6. Анализ эфирного масла  физико-химическими методами.

Если анализ эфирного масла ведут в научных целях, то сумму компонентов эфирного масла исследуют подробно. Для этого проводят разделение масла на группы соединений. Например, с помощью вакуумной разгонки при различных интервалах температур. Чаще используют метод (А.Либерти и Д.Карони) сочетающий химическое разделение масла на фракции (кислоты, фенолы, моносесквитерпеноиды и их кислородсодержащие производные) с последующа физико-химическим анализом этих фракций. Преимущество метода в том, что он менее трудоемок и масло не подвергается излишнему термическому воздействию.

 

 

Фракции эфирных масел исследуют с помощью различных хроматографических и спектрометрических методов, в том числе электронная спектроскопия, ИК-спектроскопия и ЯМР-спектроскопия.

 

Хроматографический анализ эфирных масел. 

 

Хроматография – эффективный аналитический способ разделения компонентов эфирных масел и установления в них количественных отношений. Является наиболее информативным при исследовании и установлении качества эфирных масел.

Для проведения хроматографии с помощью микрошприца отбирают небольшой объем (0.04-0.06 мкл) эфирного масла и вводят при температуре 230-2500С в испаритель хроматографа. После испарения пары эфирного масла поступают в виде смеси с газом-носителем в узкую кварцевую капиллярную трубку длиной 30 метров и внутренним диаметром 0.25 мм. Под действием постоянно протекающего через эту трубку газа-носителя (обычно гелий, водород или азот) эфирное масло в виде пара движется по трубке. Одновременно, для улучшения фазовых и гидродинамических условий движения пробы температуру кварцевой трубки повышают от 500С до 2200С со скоростью 3-4 градуса/мин.

Внутренняя поверхность трубки (которая называется колонка) покрыта очень тонким слоем (0.2-0.5 микрон) нейтральной жидкости полимерной природы («жидкая фаза», имеющая свое коммерческое название, например, SE-30 или Carbowax 20M, отражающее хроматографические свойства фазы). Такая хроматография называется газо-жидкостной, так как разделение анализируемой пробы на компоненты происходит на границе текущего через колонку газа-носителя и жидким слоем фазы (жидкости, покрывающим внутреннюю поверхность трубки).

Компоненты эфирного масла имеют различное адсорбционное сродство к жидкой фазе, из-за чего скорость продвижения вдоль колонки веществ, составляющих эфирное масло, отличается друг от друга. В результате компоненты выходят из колонки последовательно в виде "сгустков" фракций отдельных веществ. Обычное время анализа эфирного масла не более 30-40 мин. В современных хроматографических методиках отдельное вещество может выходить из колонки в течение 3-7 секунд. Таким образом, за время анализа можно обнаружить до сотни веществ. Эти вещества различными методами детектируются.

Основным методом обнаружения веществ, выходящих из колонки является ионизационно-пламенное детектирование. С этой целью выходной конец колонки вставляется в детектор, представляющий собой тонкое сопло с непрерывно горящим пламенем водорода. Поступающие из колонки в пламя вещества ионизируются под действием высокой температуры и обнаруживаются высокочувствительным амперметром по появлению этих ионов. Количество ионов пропорционально количеству вещества в пламени.

В результате проведения хроматографического анализа получают хроматограмму, то есть графическое изображение состава эфирного масла в виде пиков. Каждый пик соответствует одному веществу с определенным временем выхода. Размеры пика указывают на количество вещества в пробе. Количественные соотношения (обычно в виде процентного отношения) рассчитываются автоматически с помощью компьютера. В современных хроматографах процесс разделения всех веществ пробы проходит с высокой степенью воспроизводимости как с точки зрения времени выхода, так и  процентного соотношения отдельных компонентов.

На хроматограмме лавандина, полученной разделением на колонке HP-5 (малополярная метилсиликоновая фаза), пики с временем выхода 7.64 мин и 11.08 мин соответствуют главным компонентам - линалоолу и линалилацетату, содержание которых составляет 29% и 23%. Пик 8.44 мин – камфора, содержание которой 9%, 9.21 мин – борнеол (5%).  

 

Хроматограмма эфирного масла лавандина.

 

 

Так как время выхода различных компонентов эфирных масел отличается друг от друга, естественным способом их идентификации является использование этого времени, как постоянной для каждого вещества. Использование этого метода имеет существенное ограничение, так как время выхода сильно зависит от условий хроматографирования (главным образом, давления газа-носителя и температуры колонки) и поэтому используется очень редко в строго постоянных условиях работы хроматографической системы, с эфирными маслами, состав которых известен. Полученные результаты верны обычно только в пределах одной лаборатории и даже прибора. 

Более универсальным методом использования времени как хроматографической постоянной являются индексы удерживания Ковача (Kovach's retention index). Эти индексы рассчитываются по данным времени удерживания неизвестных веществ и веществ-стандартов, для которых индексы удерживания приняты постоянными. В качестве таких стандартов выбраны нормальные алканы. Например, индекс удерживания декана (алкана с 10 атомами углерода) принят как 1000, ундекана (11 атомов углерода) - 1100 и так далее. Если теперь взять неизвестное вещество и прохроматографировать в присутствии декана и ундекана, то в случае, если это неизвестное вещество выйдет по времени между этими стандартами, то его индекс удерживания будет располагаться между 1000 и 1100. Для более точных (но упрощенных) расчетов измеряют разность времен удерживания (ΔT=T2-T1) и разность индексов удерживания двух стандартных алканов (ΔRI=RI2-RI1), а также время удерживания неизвестного вещества (T) и вычисляют его индекс удерживания (RI) по формуле:

RI=RI1+ΔRI/ΔT*(T-T1)

Индекс удерживания является характеристикой определенного вещества в условиях хроматографирования на определенной жидкой фазе. Полученные индексы удерживания  имеют универсальный характер и не зависят от динамических условий хроматографирования.  Если говорить более точно, условия хроматографирования (температурные градиенты в процессе анализа, природа газа-носителя) слегка изменяют значение индексов удерживания. Но эти отклонения составляют не более 0.5 единиц для неполярных фаз и не более 5-8 - для полярных фаз. 

Результаты хроматографического анализа представляют в виде таблицы веществ, составляющих эфирное масло с указанием индекса удерживания для каждого вещества и процентного содержания каждого компонента. 

Конечно, когда разделяемые вещества имеют близкие индексы удерживания, условия хроматографирования могут привести к наложению пиков, что хорошо заметно при работе на высокоразрешающих капиллярных колонках. Тогда возникает необходимость коррекции условий анализа. Например, на неполярной фазе SE-30 (колонка HP-1) при применении газа-носителя азота происходит неполное разделение пиков пара-цимена, 1,8-цинеола и цис-β-оцимена. Использование водорода дает полное разделение этих веществ. При этом применение азота на неполярной фазе удобно для разделения триплета нерол, нераль и цитронеллол, тогда как применение водорода приводит к почти полному наложению этих пиков. Впрочем, всех этих затруднений можно избежать при анализе эфирных масел на колонке типа HP-5.

Различные режимы программирования температуры в ходе анализа также влияет на индексы удерживания. Некоторые вещества имеют "плавающие" индексы удерживания. Это происходит в случае, если проба содержит большое количество растворителя. В зависимости от величины пробы растворитель в большей или меньше степени как бы "притягивает" некоторые вещества, изменяя их индекс удерживания. Например, этилацетат в присутствии большого количества этилового спирта уменьшает свой индекс удерживания (до 10 единиц) и может совмещаться с бутанол-2 (при анализе компонентов коньячного спирта). 

 

Применение хроматографии для распознавания фальсифицированных эфирных масел. 

 

Для решения вопроса о натуральности эфирного масла проводят его хроматографический анализ и сравнивают полученную хроматограмму с хроматограммой заведомо натурального образца эфирного масла, опубликованных в специальных изданиях (метод «fingerprint analysis») или полученной анализом заведомо аутентичного образца эфирного масла. Отдельные компоненты эфирных масел обладают оптической активностью, то есть способностью вращать плоскость поляризации луча света. Синтетические вещества, которые иногда добавляют в эфирные масла, не имеют такой активности. Хроматографические методы на специальных хиральных колонках позволяют разделить оптические изомеры и установить факт фальсификации.

Разработка конкретных методических подходов, которые можно использовать при исследовании эфирных масел на натуральность представляет большую трудность. Каждое эфирное масло можно фальсифицировать различными методами. В любом случае на первом этапе необходимо получить хроматограммы эфирного масла на капиллярных колонках. При этом наиболее рационально использовать колонки с длиной 30 м, внутренним диаметром 0.25мм и слоем жидкой фазы 0.25 микрон.

Наиболее часто используют неполярную колонку с рабочей жидкой фазой на основе полиметилсилоксана (силиконовые эластомеры SE-30 или аналогичные OV-1, OV-101, DB-1, DB-5, HP-1, HP-5). Именно на этих колонках получено для эфирных масел наибольшее количество результатов (хроматограмм и индексов удерживания компонентов). Очень хорошие результаты для экспертной работы дает колонка типа HP-5 (или DB-5).

Значительно реже применяют  высокополярные колонки на основе полиэтиленгликоля с молекулярной массой 20000 (Carbowax 20M, Supelcowax10, FFAP, INNOWAX). Их используют лишь как вспомогательные в случае неоднозначной идентификации пиков на колонках с неполярной фазой. Дело в том, что при использовании хромато-масс-спектрометрии не всегда удается отличить достоверно спирты и их сложные эфиры, а также сесквитерпеновые углеводороды и некоторые их кислородные производные. Применение различных колонок дает возможность по изменению индексов удерживания одних и тех же веществ при анализе определиться с точной идентификацией.

Режим анализа на обоих колонках одинаковый. Температура испарителя и детектора 230-2500, температура термостата программируют от 500С со скоростью 30/мин до 2200 и далее изотерма 10 минут. Газ-носитель водород или гелий – все газы с чистотой 99.999. Полярные колонки дают нестабильные результаты при работе с газами с повышенным (более 0.001%) содержанием кислорода и паров воды. Скорость расхода газа через колонку приблизительно 1 мл/мин, что соответствует входному давлению для гелия 0.75 атм. Величина пробы 0.02 - 0.06 мкл при сбросе 1/50. Такой режим позволяет выявить в составе эфирного масла все компоненты с содержанием выше 0.01%, что вполне достаточно для экспертной работы.

Относительно приборной базы можно сказать, что для работы вполне достаточны обычные хроматографы практически любой конструкции (как старые, так и новые) с пламенно-ионизационным детектором. Наиболее важным при этом является правильно сконструированная система ввода пробы – самплер (иногда ее надо переделывать в хроматографах старой конструкции) и грамотное подсоединение колонки к детектору и самплеру. Но это уже вопрос очень специальный и здесь не рассматривается.

Полученные хроматограммы дают исчерпывающую информацию о составе эфирных масел и представляют собой подробную «карту» распределения всех компонентов эфирного масла, изучение которых методом сравнения с типовыми или эталонными хроматограммами может помочь в установлении подлинности и натуральности эфирного масла. При этом особое значение для установления натуральности часто имеют компоненты, содержащиеся в очень небольшом количестве, а также сесквитерпеновые терпеноиды, состав и количество которых хорошо отражает видовую принадлежность эфирного масла.