Микробиоценоз

Рис. 2. Бактериальный вагиноз (микроскопия мазка, окрашенного по Граму).

Рис. 3. «Ключевые» клетки (микроскопия мазка, окра- шенного по Граму).

Рис. 4. Цитолитический вагиноз (микроскопия мазка, окрашенного по Граму).

ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА, 1, 201318

микроорганизмов — колиформные палочки или грамположительные кокки. При обнаружении гонококков, трихомонад, ми- целия, псевдогиф, спор выставляется соответствую- щий этиологический диагноз — гонорея, трихомо- ниаз, микотический (грибковый) вагинит. Вагинальная эпителиальная атрофия (рис. 8). В зависимости от степени атрофии слизистой оболочки влагалища эпителий представлен различ- ным соотношением числа промежуточных и параба- зальных клеток, по мере нарастания атрофии увели- чивается число парабазальных и базальных клеток; количество лейкоцитов обычно не превышает 10 в поле зрения; микрофлора практически отсутствует; можно встретить единичные лактоморфотипы или морфотипы условно-патогенных микроорганизмов в редких полях зрения.

Бактериологическое исследование

Бактериологический метод диагностики до на- стоящего времени остается золотым стандартом при

изучении микроценозов различных биотопов макро- организма и в диагностике бактериальных инфекций. Широкий спектр микроорганизмов, играющих роль в формировании микробиоценоза влагалища, а также в возникновении инфекционных процессов в нем требует проведения дифференциации и иден- тификации микроорганизмов. Определение родо- вой, видовой и типовой их принадлежности явля- ется наиболее трудоемким и ответственным этапом бактериологического исследования, которое осно- вывается, в первую очередь, на основании изучения целого комплекса свойств микроорганизмов: мор- фологических, тинкториальных, культуральных, ферментативных и антигенных. При идентифика- ции микроорганизмов работают только с чистой культурой микроорганизма, поскольку присутствие посторонних микроорганизмов может исказить ре- зультаты исследования и послужить поводом для ошибочного заключения. Бактериологическое ис- следование проводится в несколько этапов, требует не только приготовления большого количества пи-

Рис. 5. Кандидозный вагинит (микроскопия мазка, окра- шенного по Граму).

Рис. 6. Сочетание бактериального вагиноза и кандидозно- го вагинита (микроскопия мазка, окрашенного по Граму).

Рис. 7. Неспецифический вагинит (микроскопия мазка, окрашенного по Граму).

Рис. 8. Вагинальная эпителиальная атрофия (микроско- пия мазка, окрашенного по Граму).

ИННОВАЦИИ В КЛИНИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ

ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА, 1, 2013 19

тательных сред, реактивов, диагностикумов, особых условий культивирования, но и наличия специально подготовленных врачей-бактериологов, что делает этот метод исследования весьма дорогостоящим. Важным фактором, значительно влияющим на успех бактериологической диагностики БВ, явля- ется корректный способ взятия и транспортировки биологического материала. Так, взятие биологиче- ского материала должно всегда осуществляться до начала лечения биотерапевтическими или анти- бактериальными препаратами или не ранее чем че- рез 10 дней после окончания их приема, а также до начала проведения других местных терапевтических вмешательств. Накануне взятия биологического ма- териала пациентка не должна иметь половую связь. Для сохранения бактерий в жизнеспособном состоянии in vitro и предотвращения их гибели во время транспортировки биологического материала исследуемый материал транспортируется в специ- альных транспортных средах в максимально корот- кие сроки. В настоящее время бактериологи рас- полагают большим арсеналом коммерческих уни- версальных транспортных сред, которые способны сохранять в жизнеспособном состоянии весь спектр культивируемых микроорганизмов. В зависимости от цели исследования, которая определяется в необходимости проведения точной количественной оценки микрофлоры или возмож- ностью ограничиться ориентировочным (полуко- личественным) методом, вагинальное отделяемое высевается на питательные среды двумя методами: 1) взятие вагинального отделяемого произво- дится с помощью калиброванной петли диаметром 3 мм или ложечки Фолькмана, затем биологический материал погружается в 1 мл жидкой транспортной среды, далее готовятся серийные разведения из рас- чета 10:1 (объем/масса) и затем по 0,1 мл высевают на различные селективные питательные среды; 2) взятие вагинального отделяемого произво- дится микробиологическим тампоном и засевается на среду обогащения (тиогликолевая среда) и на половину чашки Петри с селективной питательной средой с последующим рассевом методом истоще- ния. Степень роста бактериальной флоры определя- ется в первом случае в пересчете на 1 мл вагинально- го отделяемого (в КОЕ/мл), а во втором случае, при полуколичественной оценке используются четыре уровня (градации) микробного обсеменения: — со среды обогащения, при росте бактериаль- ной флоры только на жидкой питательной среде; — скудный рост, при росте бактериальной фло- ры на плотной питательной среде в количестве до 10 колоний микроорганизмов одного вида; — умеренный рост, при росте бактериальной флоры на плотной питательной среде в количестве от 10 до 100 колоний микроорганизмов одного вида;

— обильный рост, при росте бактериальной флоры на плотной питательной среде в количестве более 100 колоний микроорганизмов одного вида. Несмотря на его высокую стоимость и сложность проведения, бактериологическое исследование остается наиболее достоверным этапом в диагно- стике бактериальных инфекций. Кроме того, этот метод на сегодняшний день остается единственным в части изучения антибиотикочувствительности бактериальной флоры, что необходимо при подборе адекватной антибактериальной терапии при бакте- риальных инфекциях, вызванных антибиотикоре- зистентными штаммами [40, 52, 53]. При БВ проведение бактериологического ис- следования ввиду его длительности и высокой сто- имости нецелесообразно и экономически не выгод- но. Поскольку в большинстве случаев при лечении БВ назначаются препараты нитроимидазольного ряда (метронидазол, тинидазол и т.д.), к которым у анаэробной микрофлоры не развивается резистент- ности, нет необходимости в определении антибио- тикочувствительности, которая может быть выпол- нена только бактериологическим методом. В дан- ном случае возможно использование комбинации методов лабораторной диагностики, выполнение которых возможно в более короткие сроки, и их суммарная стоимость гораздо ниже, чем у бактери- ологического метода, а чувствительность и спец- ифичность превышают его показатели.

Молекулярно-биологические методы диагностики БВ

Долгое время применение молекулярно-био- логических методов, в частности метода ПЦР, для диагностики БВ многими специалистами воспри- нималось скептически, несмотря на то что для диа- гностики других инфекционных заболеваний они постепенно вытесняли микроскопический, имму- нологический и даже бактериологический методы. Высокая аналитическая чувствительность молеку- лярно-биологических методов, столь важная ха- рактеристика для выявления патогенных микроор- ганизмов, затрудняет клиническую интерпретацию результатов при выявлении условно-патогенных микроорганизмов, которые в норме в небольших количествах могут присутствовать в урогенитальном тракте человека. Даже искусственное занижение чувствительности ПЦР-теста, позволяющее отсечь из рассмотрения случаи с низкой концентрацией ус- ловно-патогенных микроорганизмов, не повышает его информативности, поскольку при БВ значение имеет не просто абсолютное повышение количества анаэробной и факультативно-анаэробной флоры, а преобладание ее по отношению к количеству лак- тобактерий. Поэтому применяемый в клинической лабораторной диагностике тест на основе ПЦР для качественного выявления G. vaginalis нельзя рассма- тривать в качестве теста для диагностики БВ и тем

ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА, 1, 201320

более опираться на его результаты при принятии ре- шения о назначении лечения. С появлением метода ПЦР в реальном времени, возможности молекуляр- но-биологической диагностики инфекций, вызван- ных условно-патогенной флорой, и в частности БВ, значительно расширились. Метод позволяет прово- дить количественную оценку ДНК микроорганиз- мов, а также выявлять сразу несколько мишеней в одной реакции (мультиплексная ПЦР в реальном времени). На основе такой модификации метода ПЦР было предложено несколько вариантов диа- гностики БВ, в основе которых лежит количествен- ное определение G. vaginalis и A. vaginae и которые в комбинации имеют высокое предсказательное зна- чение для БВ [70—73]. Кроме того, A. vaginae являет- ся не только высокоспецифическим маркером БВ, но обладает видовой устойчивостью к метронидазо- лу, и его выявление требует корректирования про- токола лечения пациентов [74—76]. В отечествен- ной практике был предложен метод на основе ПЦР в реальном времени, позволяющий определять не только количество G. vaginalis и A. vaginae, но и вы- являть Lactobacillus spp, а также общую бактериаль- ную массу в качестве маркера качества получения материала для исследования [77]. На основе значе- ний определяемых концентраций были установле- ны их соотношения, соответствующие состояниям: «бактериальный вагиноз», «промежуточное состоя- ние микрофлоры», «дисбиоз неустановленной этио- логии», а также состояние «нормоценоз».

Комплексная лабораторная диагностика бактериального вагиноза

В настоящее время клиническая практика рас- полагает достаточно большим перечнем методов лабораторной диагностики, позволяющим оценить в той или иной мере состояние микроэкологии вла- галищного биотопа. Но, к сожалению, ни один из этих методов не позволяет достоверно поставить диагноз БВ. Скрининговые методы БВ (определение рН ва- гинального отделяемого и аминотест) весьма субъ- ективны. Микроскопическое исследование вагиналь- ного отделяемого позволяет оценить состояние слизистой влагалища, исключить воспалительный процесс и наличие «ключевых клеток», но, к со- жалению, не дает возможности в полном объеме оценить качественные и количественные характе- ристики условно-патогенной бактериальной фло- ры, прежде всего микроаэрофильной — G. vaginalis, M. hominis, U. urealyticum. Кроме того, при проведе- нии микроскопического исследования не исклю- чены проблемы, связанные с гипердиагностикой, в случае определения «ложноключевых клеток». Хотя бактериологическое исследование и позволяет по- лучить наибольшую информацию о количествен-

ных и качественных взаимоотношениях микрофло- ры во влагалищном биотопе, но, к сожалению, не дает ответа на самый главный вопрос — воспаление есть или нет? Кроме того, даже при проведении это- го метода исследования невозможно в полном объ- еме оценить состояние микрофлоры влагалища из- за наличия в ее составе некультивируемых и трудно культивируемых микроорганизмов. Появление в клинической практике молекуляр- но-биологических методов диагностики до некото- рой степени расширило наше представление о ми- кробиоценозе влагалища. Использование этих ме- тодов позволило верифицировать микроорганизмы непосредственно в вагинальном отделяемом, минуя такие сложные этапы бактериологического иссле- дования, как культивирование и выделение чистой культуры. Кроме того, молекулярно-биологические методы диагностики позволили решить самую боль- шую проблему бактериологического метода — бы- струю и качественную идентификацию анаэробных и микроаэрофильных микроорганизмов непосред- ственно в биологическом материале. Для проведе- ния этих методов диагностики не требуется наличия специальных транспортных сред и создания особых условий хранения биологического материала. Кро- ме того, время проведения молекулярно-биологи- ческих методов сопоставимо по скорости с микро- скопическим исследованием и составляет 4,5—5 ч. Единственным недостатком этих методов при диа- гностике БВ является невозможность при их прове- дении получения информации о состоянии слизи- стой влагалища и наличии или отсутствии воспали- тельной реакции в нем. В связи с этим с целью совершенствования диа- гностики БВ, получения наибольшей информации о состоянии слизистой влагалища и его микро- флоры, сокращения сроков проведения исследо- вания и его стоимости необходимо использование комбинации методов лабораторной диагностики, таких как микроскопическое исследование и моле- кулярно-биологические методы. В этом случае при проведении микроскопического исследования мы получаем информацию о состоянии слизистой вла- галища, наличии или отсутствии «ключевых клеток» и воспалительного процесса, при проведении моле- кулярно-биологических методов — соответственно информацию о качественных и количественных характеристиках анаэробной и микроаэрофильной бактериальной микрофлоры (табл. 5).

Лечение бактериального вагиноза Несмотря на то что БВ не относится к острым за- болеваниям, назначаемая при этом терапия являет- ся чрезвычайно важным и ответственным моментом не только потому, что пациентки годами мучаются выделениями, не получая соответствующей помо-

ИННОВАЦИИ В КЛИНИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ

ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА, 1, 2013 21

щи, а еще и в целях профилактики инфекционно- воспалительных заболеваний и их осложнений. Успешное лечение БВ зависит от правильной и своевременной диагностики БВ и проведения пато- генетически обоснованной терапии. Цель лечения БВ — восстановить нормальную микрофлору вла- галища, задержать рост микроорганизмов, не свой- ственных этому микробиоценозу. В настоящее время предлагается много ме- тодик для коррекции вагинальной микрофлоры. Несмотря на их многочисленность, поиски эф- фективного метода лечения ведутся и по сей день. Поскольку БВ долго рассматривался как неспец- ифический вагинит, а H. Gardner и C. Dukes еще в 1955 г. причиной вагинита назвали Haemophylus vaginalis, то и предложенные методы лечения были направлены против этого микроаэрофильного ми- кроорганизма. При этом использовали перорально тетрациклин и интравагинально содержащий серу крем.

Исходя из представлений, что БВ является не- воспалительным, но все же инфекционным процес- сом, многие практические врачи используют для его лечения, прежде всего антибактериальные препара- ты с различными механизмами действия. Последующие исследования показали, что при- менение таких антибактериальных препаратов, как тетрациклин, ампициллин, эритромицин, офлок- сациллин эффективно лишь в 14—54% случаев. При применении офлаксоциллина только в 43% случаев наступало излечение. Для лечения женщин с БВ в клиниках также было предложено использо- вание β-лактамных антибиотиков, например, ком- плекс амоксициллина и клавулоновой кислоты, где последняя играет роль ингибитора β-лактамаз- резистентных штаммов бактерий, таких как, напри- мер, Bacteroides fragilis. Препарат назначался по 2 г в сутки в течение 7 дней. Схема лечения предусма- тривала совмещение введения препарата путем при- ема per os и внутримышечно. Суточная доза препа-

Таблица 5. Комплексное лабораторное исследование состояния биотопа влагалища

Результат микроскопического исследования

Результат ПЦР-исследования Заключение Рекомендации

Наличие единичных лейкоцитов и еди- ничных «чистых» клеток соответственно фазе менструального цикла; доминиро- вание лактобактерий, отсутствие грам- флоры, спор, мицелия, псевдогифов

ДНК G. vaginalis и/или ДНК A. vaginae отсутствуют или их количество суще- ственно меньше количества ДНК Lactobacillus spp. На основании значе- ний параметров состояние «бактериаль- ный вагиноз» не установлено

Нормоценоз Лечение не требуется

Лейкоциты в небольшом количестве, полное отсутствие в исследуемом материале микрофлоры при неизменен- ных эпителиоцитах

ДНК G. vaginalis и/или ДНК A. vaginae отсутствуют или их количество суще- ственно меньше количества ДНК Lactobacillus spp. На основании значе- ний параметров состояние «бактериаль- ный вагиноз» не установлено

Промежуточное состояние микро- флоры

Наблюдение (повторное исследование через 1— 2 мес)

«Ключевые клетки» отсутствуют или единичные, умеренный лейкоцитоз (15— 25 лейкоцитов в поле зрения), возраста- ние количества сопутствующей грамва- риабельной полиморфной бактериаль- ной флоры

Количество ДНК G. vaginalis и/или ДНК A. vaginae близко к количеству ДНК Lactobacillus spp., но не превышает по- граничного значения. Значения параме- тров соответствуют состоянию «проме- жуточный тип микрофлоры»

Промежуточное состояние микро- флоры

Местное лечение препа- ратами, содержащими аскорбиновую или мо- лочную кислоту

«Ключевые клетки» в большом количе- стве, лейкоциты в умеренном количе- стве, присутствие бактериальной флоры в виде монокультуры или в различных морфо- и видовых сочетаниях

Количество ДНК G. vaginalis и/или ДНК A. vaginae практически равно или превы- шает количество ДНК Lactobacillus spp. Значения параметров соответствуют со- стоянию «бактериальный вагиноз»

БВ Этиотропное лечение (антибактериальная тера- пия, направленная в ос- новном против анаэроб- ной флоры)

Большое количество лейкоцитов, макро- фагов, эпителиальных клеток, выражен- ный фагоцитоз, морфологический пей- заж воспалительного процесса на фоне полного отсутствия лактобактерий и от- сутствия явно выраженного этиотропно- го возбудителя

Количество ДНК Lactobacillus spp. сни- жено относительно общего количества бактерий, при этом ДНК G. vaginalis и/ или ДНК A. vaginae отсутствуют или их количество существенно меньше коли- чества ДНК Lactobacillus spp. Значения параметров соответствуют состоянию «дисбиоз неуточненной этиологии»

Неспецифический вагинит

Проведение дополни- тельного бактериологиче- ского исследования с идентификацией бакте- риального возбудителя и определением его анти- биотикочувствительности

При обнаружении специфического этио- логического агента: трихомонад, мице- лия, псевдогифов, спор грибов — вы- ставляется соответствующий этиологи- ческий диагноз, трихомониаз, микотиче- ский (грибковый) вагинит

ДНК T. vaginalis или ДНК Candida spp. Специфический вагинит

Этиотропное лечение

ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА, 1, 201322

рата при приеме внутрь не должна была превышать 1,5 г (3 раза в сутки перед едой). При внутримышеч- ном введении доза рассчитывалась таким образом, чтобы количество клавулоновой кислоты не превы- шало 200 мг на инъекцию и 1200 мг в сутки. Широкое применение в лечении инфекцион- ных заболеваний урогенитального тракта нашли также метронидазол и клиндамицин [52, 60, 64]. Метронидазол относится к группе антибактериаль- ных препаратов, содержащих имидазольное кольцо. В течение многих лет препарат применялся в лече- нии трихомонадной инфекции, при лямблиозе и амебиазе. Проникая внутрь микробной клетки, ме- тронидазол превращается в активную форму, свя- зывается с ДНК и блокирует синтез нуклеиновых кислот. Известно, что применение метронидазола в различном режиме эффективно и при БВ. Пероральное применение метронидазола в до- зах от 500 мг 3 раза в сутки в течение 5—7 дней ведет к излечению заболевания у 90% пациенток. Назна- чение 2 г метронидазола однократно также высоко- эффективно, как и 5—7 дневные курсы в 80—90% случаях, однако столь большую дозу метрони- дазола можно применять лишь у ограниченного контингента женщин, не отягощенных сопутству- ющей патологией. Поскольку в различных иссле- дованиях было установлено, что A. vaginae обладает повышенной устойчивостью к метронидазолу, то применение его при БВ, ассоциированным с A. va- ginae, может приводить либо к отсутствию эффек- та лечения, либо к развитию рецидивов. В связи с этим необходимо применять альтернативные схе- мы лечения. Клиндамицин представляет собой хлорирован- ное производное линкомицина и имеет преимуще- ство перед последним, поскольку обладает большей антибактериальной активностью и легче адсорбиру- ется из кишечника. Препарат связывается с рибосо- мами и ингибирует синтез белка. Он активен в от- ношении облигатно-анаэробных микроорганизмов. Перорально препарат назначают по 300 мг 2 раза в сутки в течение 7 дней. Период полувыведения клиндамицина составляет 3 ч. Результаты исследо- ваний эффективности клиндамицина показали, что у 91% пациенток с БВ наблюдалось клиническое выздоровление. Среди частых осложнений при применении для лечения БВ вышеизложенных препаратов следует отметить кандидозный вульвовагинит (6—16%). Для его профилактики необходимо назначать антифун- гальные препараты: нистатин по 2000 мг в сутки в течение 5 дней или флуконазол 1 таблетка (150 мг) внутрь одновременно с началом лечения. Однако пероральный прием препаратов может осложняться развитием псевдомембранозного колита, диареей. Учитывая то, что наряду с высокой эффективно- стью при пероральном применении данных тера-