Вирус бешенства

Отбор проб мозга для исследования на бешенство.

Отделить голову от туловища и хорошо зафиксировать. Снять кожу и мышцы с черепной коробки, сделав надрезы между глазными впадинами и от них в сторону затылка. С помощью пилы, топора, ножниц и пинцета снять черепную коробку. Отделить основные нервы, изъять мозг и поместить его на кювету или доску. Отобрать пробы коры больших полушарий и основания спинного мозга.

Для исследования на бешенство необходимо брать пробы аммоновых рогов. Для этого нужно рассечь продольными разрезами каждое центральное полушарие на расстоянии 2 см (для собак) от средней линии мозга, удалить верхние части до щели (пространства), в котором находятся аммоновы рога, представляющие собой полуцилиндрические тела белого цвета.

Нужно взять несколько кусочков аммоновых рогов и основания спинного мозга. Общий вес каждой пробы должен быть 5-10 г. Пробы мозга для исследования на бешенство обычно консервируют глицерином и маркируют с пометкой «бешенство».

Вскрывать подозрительных на заболевание бешенством животных в полевых условиях запрещено!

3.3. Этапы лабораторной диагностики.

Индикация вируса.

Из каждого отдела головного мозга левой и правой сторон (аммонова рога, мозжечка, коры полушарий и продолговатого мозга) готовят по 4 препарата – мазки-отпечатки для реакции иммунной флуоресценции (РИФ) и обнаружения телец Бабеша-Негри; с мозговой тканью ставят реакцию диффузной преципитации (РДП).

а) Обнаружение телец Бабеша-Негри при помощи световой микроскопии.

Приготовленные мазки-отпечатки окрашивают по Серерсу, Муромцеву или другими методами. Препараты после окрашивания просматривают в световом микроскопе с иммерсионной системой. Положительным результатом считают наличие специфических телец Бабеша-Негри. Это четко очерченные овальные или продолговатые гранулярные образования розово-красного цвета в протоплазме (при окраске по Селерсу); при окраске по Муромцеву – тельца Бабеша-Негри светло-фиолетовые с темно-синими включениями, чаще они располагаются вне нервных клеток. Тельца Бабеша-Негри выявляют лишь в 40 – 45 % случаев бешенства. У взрослых животных включений больше, чем у молодых. Если животное убито в начале болезни, то тельца не находят, поэтому собак не убивают при неясных клинических признаках, а наблюдают за ними 10 дней, дают проявиться клиническим признакам. У диких животных тельца обнаруживают реже, лишь у 30% больных животных. Поэтому отсутствие их не является отрицательным ответом и материал исследуют в других тестах (реакции иммунной флуоресценции (РИФ), реакцию диффузной преципитации (РДП), биопроба).

Посмертно исследуют срезы аммоновых рогов головного мозга и обнаруживают в них специфические включения - тельца Бабеша-Негри. Тельца Бабеша-Негри также присутствуют в цитоплазме нейронов, гиппокампе, клетках Пуркинье коры мозжечка, стволе мозга, гипоталамусе и спинномозговых ганглиях. Данные тельца присутствуют в головном мозге только при бешенстве, наличие их при других заболеваниях, в том числе и при заболеваниях центральной нервной системы, не зафиксировано. Состоят тельца Бабеша-Негри из тонковолокнистого матрикса и вирусного рибонуклеопротеида, размер телец - около 10 нанометров.

б) Обнаружение вирусного антигена с помощью серологических реакций.

Реакция иммунной флуоресценции является одним из основных тестов при диагностике бешенства. При высококвалифицированном выполнении получают 99 – 100% совпадения с методом биопробы. Обычно в диагностической практике используют прямой метод РИФ, который проводят по общепринятой методике с применением антирабического флуоресцирующего иммуноглобулина. 
Принцип реакции иммунной флуоресценции (РИФ) - серологическая реакция АТ связанные с флюоресцирующим веществом (метка) сохраняет способность вступать в специфическое взаимодействие с гомологичными АТ, комплекс АТ-АГ, который можно обнаружить по характерному свечению в люминесцентном микроскопе. 
 
Антиген вируса бешенства выявляется в виде ярких желто-зеленых или зеленых гранул различных форм и величины в клетках (чаще вне клеток). Диагноз считают установленным, если в нескольких полях зрения обнаруживают достаточное количество (не менее 10) типичных гранул с ярким зеленым свечением или множество мельчайших точек – «песка». В контроле подобного свечения не должно быть.

Метод дает возможность обнаруживать вирус бешенства в клетках роговицы глаза и прижизненно поставить диагноз. Метод может быть использован для исследования животных, подозреваемых в заболевании бешенством, а также клинически здоровых собак и кошек, покусавших людей и животных. Для этого готовят отпечатки с роговицы (соблюдая все правила личной профилактики). Раскрывая глазную щель животного большим и указательным пальцами, на слегка выпяченное глазное яблоко надавливают поверхностью предметного стекла, отступив на 0,5 см от конца. Следует следить, чтобы животное не моргало третьим веком, так как при этом со стекла удаляются эпителиальные клетки и получается некачественный мазок.

Результаты микроскопии считают положительными, если в отпечатках роговицы животного обнаруживают 11% и более клеток с характерными очажками свечения. Необходимо иметь в виду, что в препаратах от здоровых животных (контроль) вследствие аутофлуоресценции могут встречаться единичные клетки с подобными по форме и свечению очажками. Метод РИФ дает возможность ускорить ответ при окончательной постановке диагноза методом биопробы. Диагноз может быть установлен уже на 4 – 8 день после заражения мышей исследуемым материалом, а инкубаторный период заболевания мышей достигает 20 дней. РИФ может выявить вирус бешенства в тканях подчелюстной слюнной железы.

Иммуноферментный анализ. Метод основан на принципе сорбции белков на твердой фазе с последующим образованием комплексов антиген-антитело, выявляемых субстрат-индикаторным раствором. Добавляемый в лунки антиген специфически связывается с антителами. На слой антигена наносят исследуемые сыворотки в нужных разведениях. При наличии в них специфических антител последние связываются с антигеном. Для выявления связывания на слой антител наносят иммуноглобулин против глобулинов сыворотки людей, конъюгированный с пероксидазой хрена. Количество сорбирующего конъюгата пропорционально количеству связавшихся с антигеном антител сывороток людей. Это можно определить, используя индикаторный раствор (ортофенилилендиамин + перекись водорода), компоненты которого в результате действия пероксидазы конъюгата окрашивают жидкость в коричнево-желтый цвет. При обследовании неясных случаев применение ИФА дополнительно к методам РП или РСК позволяет увеличить достоверность лабораторной диагностики бешенства, благодаря большой чувствительности этого метода. Метод позволяет обнаруживать инфекционные и дефектные частицы.

Для определения антирабических антител в процессе вакцинации можно применять непрямой метод ИФА, используя в качестве антигена очищенный вирус, а для определения антител класса IgG в человеческой сыворотке — А-белок стафилококка, связанный с пероксидазой хрена. Результаты ИФА сравнимы с полученными в тестах вирусной нейтрализации на мышах. Метод позволяет выявлять присутствие IgМ в начале процесса иммунизации.

Иммуноферментные методы — весьма перспективны для выявления нуклеокапсидного антигена вируса при посмертной диагностике в тканях головного мозга. В их числе, например, быстрый иммуноферментный метод диагностики бешенства, основанный на приготовлении плашек сенсибилизированных антителами IgG изотипа к нуклеокапсиду первого серотипа, разведенных в карбонатном буфере.

Материал для исследования гомогенезируют в буфере или культуральной среде, осветляют центрифугированием, вносят в лунки и инкубируют в плашках. Фиксированный специфическими антителами нуклеокапсидный антиген идентифицируют добавлением пероксидазного конъюгата с антинуклеокапсидными противорабическими антителами иной видоспецифичности и хромогенного субстрата. Чувствительность метода составляет 0,8–1,0 нг/мл.

Этим методом можно выявлять антигены вирусов различных серотипов. Применение конъюгатов нуклеокапсидспецифичных антител, меченых биотином, повышает чувствительность метода до 0,1–0,2 нг/мл.

Методом ИФА успешно выявляется антиген нуклеокапсида, но материал, даже разложившийся, не должен фиксироваться формалином.

Реакцию диффузионной преципитации применяют для обнаружения антигена вируса бешенства в неконсервированном головном мозге животных, павших от уличного бешенства, или мышат, используемых в биопробе. РДП ставят микрометодом на предметных стеклах. Для этого используют 10% суспензию из головного мозга. Реакцию учитывают через 6, 24, 48 часов. При наличии одной или двух-трех линий преципитации между лунками, содержащими антиген и иммуноглобулин, реакцию считают положительной. РДП проста по выполнению и специфична, но процент выявления вирусного антигена в исследуемом материале от 45 до 70. При исследовании головного мозга мышей, полученного при положительной биологической пробе, РДП выявляет антиген в 100% случаев.

Если хотя бы один из методов дал положительный результат, то диагноз бешенство сразу подтверждается. Однако отсутствие в исследуемом материале телец Бабеша-Негри, специфической флуоресценции и отрицательная РДП не дают основания исключить наличие вируса. В этом случае окончательный диагноз ставят по результатам биопробы на белых мышатах и последующей идентификации вируса.

в) Метод полимеразной цепной реакции.

Для экспресс-диагностики вируса бешенства и идентификации лиссавирусов наиболее удобен метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод ПЦР — самый надежный и быстрый для выделения вирионной РНК из любых проб, содержащих вирус в низкой концентрации. С его помощью можно создать много копий РНК вируса. Этот метод используется для подтверждения результатов МФА и для определения вируса в слюне, луковицах волос заднего отдела шеи и головы.

ПЦР основана на принципе естественной репликации ДНК. Суть метода заключается в многократном повторении циклов синтеза (амплификации) вирусоспецифической последовательности ДНК с помощью термостабильной Taq ДНК-полимеразы и двух специфических затравок, так называемых праймеров.

Каждый цикл состоит из трех стадий с различным температурным режимом. В каждом цикле удваивается число копий синтезируемого участка. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации, что позволяет за 25–35 циклов наработать достаточное число копий выбранного участка ДНК для ее определения, как правило, с помощью электрофореза в агарозном геле.

Особенно высокая чувствительность ПЦР при использовании праймеров, комплементарных N-гену, когда удается выявлять РНК вируса в пробах, содержащих вирус в титре 10 МЛД50. Методом ПЦР можно выявлять РНК вируса даже в разложившемся патологическом материале.

В настоящее время разработаны и широко используются на практике подтверждающие (конфирматорные) тесты, такие как ПЦР в обратно-транскриптазном исполнении (ОТ-ПЦР). Метод ОТ-ПЦР — высокочувствительный и наиболее эффективный. РНК экстрагируется из тканей инфицированного вирусом органа, транскрибируется в кДНК, которая затем амплифицируется методом ПЦР. Для постановки ОТ-ПЦР необходимы праймеры, полученные к консервативным областям генома вируса бешенства. Обычно используются гены, кодирующие нуклеопротеин или N-белок.

Метод ПЦР высокоспецифичен и очень чувствителен. Является одним из наиболее точных тестов детекции рабического антигена, позволяет диагностировать бешенство даже при наличии в материале хотя бы одного вириона. В основе теста лежит комплементарное достраивание РНК-матрицы, осуществляемое in vitro с помощью фермента РНК-полимеразы. В последние годы ПЦР находит все более широкое применение для диагностики и мониторинга вирусных инфекций. Однако методика проведения сложна, дорогостояща и пока недостаточно унифицирована для рутинного применения.

Изоляция вируса.

Принято считать, что биопроба является наиболее эффективным методом. Из всех видов, использованных для биопробы животных (кролики, морские свинки, взрослые белые мыши и хомяки), многие отдают предпочтение мышам-сосунам, поскольку они более чувствительны к разным штаммам вируса бешенства и менее опасны в работе. Сирийские хомяки по чувствительности не уступают мышами, но они менее доступны. В диагностической практике рекомендуется следующая методика постановки биопробы. Для каждой исследуемой пробы полевого материала используют 6 - 10 молодых мышат (массой 16 -20 г) или сосунков в возрасте 20 -25 суток (массой 6 – 8 г), которых заражают 10%-ной суспензией, приготовленной из всех отделов головного мозга, по общепринятой методике: 50 % мышат заражают интрацеребрально дозой 0,015 – 0,03мл (в зависимости от массы мышей) и 50 % - подкожно в верхнюю губу дозой 0,1 – 0,2 мл. За зараженными мышами наблюдают ежедневно в течение 30 дней. Гибель в течение 24-48 часов не учитывают. Отрицательный диагноз — отсутствие гибели мышат в течение 30 дней. При наличии вируса в исследуемом материале у мышей на 6-10-15-20-ый дни развиваются следующие клинические признаки: взъерошенность шерсти, своеобразная горбатость спины, нарушение координации движения, паралич задних, затем передних конечностей и гибель. При признаках положительной биопробы от павших мышей отбирают головной мозг для идентификации вируса.

Вирус репродуцируется в первичных и перевиваемых культурах клеток (почках сирийского хомячка, эмбрионах овец, телят, ВНК-21, клетках невриномы Гассерова узла крысы и др.). В первых пассажах вирус размножается медленно, не вызывая ЦПД. К вирусу бешенства после предварительной адаптации восприимчивы и куриные эмбрионы.

Идентификация выделенного вируса.

Иммуноферментный анализ разработан и успешно применяется в ряде стран для обнаружения вируса бешенства (реакция ELISA). Метод точный, быстрый, дающий высоковоспроизводимые результаты и доступен для выполнения.

В ИФА специфическое окрашивание АГ в клетках мозга павших от бешенства мышей выявляют как в свежевзятых, хранившихся в глицерине, а также в пробах, хранившихся без глицерина при 20°С в течение 8-18 часов.

Данный тест пригоден для рутинной диагностики бешенства у животных, для выявления АГ вируса бешенства в тканевых парафиновых срезах при фиксации препаратов 10%-ым раствором формалина с pH=5,3 и последующей обработки препаратов, заключенных в парафин, пепсином.

Pеакция нейтрализации используется редко. Рекомендуется модификация с разведением вируса бешенства и постоянной дозы у-глобулина.

Реакция торможения гемагглютинации. Пока еще не нашла широкого применения в диагностической практике из-за наличия в сыворотках крови неспецифических ингибиторов, к которым вирус бешенства высокочувствителен, а главное, гемагглютинирующие АГ, не подвергавшиеся достаточной очистке, обладали низкой чувствительностью. Для приготовления гемагглютинирующего АГ вируса бешенства предложено использовать штамм «Москва», выращенный в культуре клеток ВНК-21, после его обработки сапонином с последующей очисткой и концентрированием. Гемагглютинины отделяют от других компонентов вириона ультрацентрифугированием. Полученный препарат имел степень очистки 99,92%, обладал высокой гемагглютинирующей активностью (1:128), хорошо сохраняющейся в течение 1 месяца при рН 5-9.

Перед постановкой РТГА следует проводить умеренную двукратную трипсинизацию гусиных эритроцитов для их сенсибилизации. При использовании 0,25%-ной взвеси трипсинизированных эритроцитов (лучше 107 клеток в 1 мл) чувствительность РТГА повышается в 4 раза. Для разбавления АГ и сывороток применяют боратно-солевой раствор (рН 9) с добавлением 0,4% бычьего сывороточного альбумина. Взвесь эритроцитов готовят в солевом растворе с кислым рН, чтобы после соединения со смесью вируса и сывороток, рН которой 9, окончательный рН установился бы в пределах 6,2. После внесения в лунки суспензии эритроцитов панель встряхивают, заклеивают прозрачной пленкой и ставят на лед. Результаты РТГА учитывают через 40-50 минут, а с эритроцитами двухдневных цыплят или макаки-резус - через 1-1,5 часа.