Ионообменная хроматография в фармацевтическом анализе

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ  УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО  ОБРАЗОВАНИЯ «ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ  УНИВЕРСИТЕТ»

 

 

 

Курсовая работа на тему:

«Ионообменная хроматография в фармацевтическом анализе»

 

 

 

Выполнил: студент IV курса 1й группы

дневного  отделения

фармацевтического факультета

Бугаёв  Фёдор Сергеевич

 

 

 

 

Воронеж  2013 

Содержание.

1. Введение………………………………………………………………….….3
2. Сущность метода. Ионообменники. Ионное равновесие………………...6
3. Селективность ионного обмена и факторы его определяющие………...16
1. Принцип работы ячейки...………………………………………….…18
4. Методы ионообменной хроматографии…………………………………..21
1. Кондуктометрическая анионная хроматография: двухколоночные методы……………………………………………………………….…21
2. Кондуктометрическая катионная хроматография: двухколоночные методы……………………………………………………………….…30

4.3.Кондуктометрическая катионная  хроматография: одноколоночные методы…………………………………………………………………....…36

4. Кондуктометрическая анионная хроматография: одноколоночные методы……………………………………………………………..…39
5. Применение ионообменной хроматографии ……………………………44
1. Применение ионообменных смол в сорбционной очистке этанола от микропримесей…………………………………………………..44
2. Применение ионообменной хроматографии для разделения изоформ малатдегидрогеназы из Sphaerotilus natans штамм Д-507, культивируемых в условиях миксотрофного роста…………..….48
3. Применение ионообменной хроматографии для очистки аконитатгидратазы из миокарда крысы в условиях нормы и при индукции апоптоза…………………………………………………53
4. Особенности сорбции этаналя полифункциональным анионообмеником…………………………………………….……59
5. Термодинамическое описание сорбции тирозина анионообменником АВ-17-2П в форме триптофана………….…65

Список литературы………………………………………………………..70

 

1. Введение.

 

     Заметный вклад в развитие  хроматографического метода внес  Г. Шваб (Германия), явившийся основателем  ионообменной хроматографии (1937 – 1940). Дальнейшее развитие она  получила в работах советских  ученых Е.Н. Гапона и Т.Б.  Гапона, которые провели хроматографическое  разделение смеси ионов в растворе (совместно с Ф.М. Шемякиным, 1947), а также осуществили высказанную  еще Цветом идею о возможности  хроматографического разделения  смеси веществ на основе различия  в растворимости труднорастворимых  осадков (осадочная хроматография, 1948).

     Современный этап в развитии  ионообменной хроматографии начался  в 1975 г. после работы Г. Смолла, Т. Стивенса и У. Баумана (США), в которой они предложили новый аналитический метод, названный ионной хроматографией (вариант высокоэффективной ионообменной хроматографии с кондуктометрическим детектированием).

     Сегодня хроматография находит  применение в самых различных  отраслях научной и практической  деятельности человека. Так, в  аналитической химии это уникальный  метод разделения и анализа  сложных многокомпонентных смесей. Велика роль хроматографии в  контроле окружающей среды. В  промышленности она стала не  только рутинным методом контроля  производства и качества продукции,  но и промышленным методом  выделения и обогащения ценных  продуктов, имеющим во многих  случаях преимущество перед традиционно  используемыми ректификацией и  кристаллизацией.

Определение неорганических и органических ионов  является практически важной и достаточно сложной аналитической проблемой. Наиболее общим и универсальным  методом решения этой задачи является ионообменная хроматография. Развитие высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления стимулировало развитие нового направления в ионообменной хроматографии - так называемой ионной хроматографии.

Ионная  хроматография - это вариант ионообменной хроматографии, включающий ионообменное разделение ионов и кондуктометрическое  определение концентрации хроматографически  разделенных ионов. Поскольку высокочувствительное кондуктометрическое определение  ионов возможно только при невысокой  фоновой электропроводности потока жидкости, поступающей в детектор, были предложены два основных метода ионной хроматографии.

Первый  метод, предложенный в 1975 г. Смолом, Стивенсом и Бауманом, основан на компенсации (подавлении) электролита с помощью второй ионообменной колонки, расположенной между детектором и разделяющей колонкой. Этот метод назван ионной хроматографией. В настоящее время этот термин используется в более широком смысле - для обозначения нового направления в целом.

Второй  метод, предложенный Гьрде, Фритцем  и Шмуклер, основан на использовании  для разделения электролита с  невысокой электропроводностью. Вторая (подавительная)колонка в этом случае не используется.

Методу  ионной хроматографии присущи следующие  особенности: 1) использование новых  поверхностно-слойных сорбентов  с небольшой емкостью (порядка 10^-2-10^-2 мэкв/г) и небольшим размером частиц (5-50 мкм) для разделения ионов; 2) повышение скорости потока и, следовательно, повышение давления на входе колонки (≈2-15 МПа); 3) использование высокочувствительных детекторов с автоматической записью сигнала, пропорционального концентрации разделенных ионов. Например, использование кондуктометрического детектора позволяет определять ионы с концентрацией порядка 10^-3 мкг/мл (применение концентрирующей колонки позволяет уменьшить это значение на 2-3 порядка величины).

Широкое распространение  ионной хроматографии обусловлено  рядом ее достоинств:

а) возможность определять очень большое число неорганических и органических ионов, а также одновременно определять катионы и анионы;

б) высокая чувствительность определения (до 1 нг/мл без предварительного концентрирования);

в) высокая  селективность и экспрессность (можно  определять 10 ионов за 10-15 минут, а  при градиентном элюировании - 22 иона за 25 мин);

г) малый  объем анализируемой пробы (требуется  не более 2 мл образца);

д) широкий  диапазон определяемых концентраций (от 1 нг/мл до 1000 мг/л без разбавления) [4,8];

 

2. Сущность метода. Ионообменники. Ионное равновесие.

 

В ионообменной хроматографии разделение компонентов  смеси достигается за счет обратимого взаимодействия ионизирующихся веществ  с ионными группами сорбента. Сохранение электронейтральности сорбента обеспечивается наличием способных к ионному  обмену противоионов, расположенных  в непосредственной близости к поверхности. Ион введенного образца, взаимодействуя с фиксированным зарядом сорбента, обменивается с противоионом. Вещества, имеющие разное сродство к фиксированным зарядам, разделяются на анионитах или на катеонитах. Аниониты имеют на поверхности положительно заряженные группы и сорбируют из подвижной фазы анионы. Катиониты соответственно содержат группы с отрицательным зарядом, взаимодействующие с катионами. Амфотерные (биполярные) иониты содержат в своей матрице и катионные и анионные обмениваемые группы. Эти иониты способны образовывать внутренние соли, которые диссоциируют в контакте с электролитами и связывают оба их компонента. Амфотерные иониты легко регенерируются водой[1,4,7.8].

В качестве ПФ в ионообменной хроматографии  используют ионные растворы (водные растворы солей, кислот и оснований), т.е. системы  растворителей, имеющих высокое  значение диэлектрической проницаемости  и способность ионизировать соединения. Обычно работают с буферными растворами, поддерживающими определенные значения рН.

При хроматографическом разделении ионы анализируемого вещества конкурируют с ионами, содержащимися  в элюенте, стремясь вступать во взаимодействие с противоположно заряженными группами сорбента. Отсюда следует, что ионообменную хроматографию можно применять  для разделения любых соединений, которые могут быть каким-либо образом  ионизированы.

Ионообменная  хроматография целесообразна при  разделении высокополярных веществ, которые  без перевода в производные не могут быть проанализированы методом  ГЖХ. К таким соединениям относятся  аминокислоты, пептиды, гетероциклические  основания, углеводы.

Механизм  анионного обмена можно представить  в виде уравнения:

X^- + R⁺Y^- ↔ Y^- + R⁺X^-

Аналогично  уравнение для катионного обмена:

Х⁺ +R^-Y⁺ ↔ Y⁺ + R^-X⁺

В первом случае ион образца X^- конкурирует с ионом подвижной фазы Y^- за ионные центры R⁺ ионообменника, а во втором в конкуренцию с ионами подвижной фазы Y⁺ за ионные центры R^- вступают катионы образца Х⁺ (рис 1).

Рис 1. Схематическое  изображение обмена ионами между  ионитом и раствором.

Зерно катионита, насыщенного противоионами А. помещают в раствор, содержащий противоионы В (слева). В результате диффузии происходит перераспределение ионов между ионитом и раствором. После установления равновесия (справа) ионит и раствор содержат ионы А и В в определенных количественных соотношениях (здесь 1 : 1 и 2 : 1). Число противоионов в ионите должно всегда удовлетворять условию электронейтральностн.

 

 

 

 

 

 

Естественно, что ионы анализируемой пробы, слабо  взаимодействующие с ионообменником, при этой конкуренции будут слабо  удерживаться в колонке и первыми  вымываться из нее и, наоборот, наиболее сильно удерживаемые ионы будут элюированы из колонки последними. Кроме ионных-ионных взаимодействий на поверхности сорбента возникают вторичные взаимодействия неионной природы за счет адсорбции или водородных связей сорбента с неионной частью матрицы или за счет ограниченной растворимости образца в подвижной фазе. Трудно добиться условий, при которых удерживание осуществляется только по ионообменному механизму. Поэтому при прогнозировании удерживания необходимо исходить не только из теоретических закономерностей ионообменной хроматографии, но и из эмпирических наблюдений. Разделение конкретных веществ зависит в первую очередь от выбора наиболее подходящего сорбента и подвижной фазы. В качестве неподвижных фаз в ионообменной хроматографии применяют ионообменные смолы и силикагели с привитыми ионогенными группами.

Применяемые в ВЭЖХ ионообменные смолы представляют собой в основном сополимеры стирола  и дивинилбензола. Относительное  содержание дивинилбензола, определяющее степень сшивки скелета ионита выражают в массовых процентах дивинилбензола в мономерной смеси. Обычно добавляют 8-12% последнего. Чем больше содержание дивинилбензола, тем больше жесткость и прочность полимера, выше емкость и, как правило, селективность и тем меньше набухаемость.

Хроматографические  материалы, содержащие сульфатные или  триалкиламмонийные группы, являются сильными катионнообменниками и  сильными анионообменниками и называются соответственно SCX и SAX. Слабые катионообменники и анионообменники получают на основе ионов карбоксилата -СОО^- или аммония -NH3⁺ соответственно. Существуют также жидкие органические ионообменники - несмешивающиеся с водой жидкости, физически нанесенные на пористые или поверхностно-пористые материалы. Жидкие анионообменники - высокомолекулярные амины или их соли, а катионообменники - эфиры фосфорной или фосфиновых кислот.

Для улучшения  условий разделения в ионообменной хроматографии иногда получают лигандные  комплексы ионов, изменяя при  этом их полярность

Fe₃⁺ + 4Сl^- ↔ FeCl₄^-

и делят на анионообменном носителе анионы тетрахлоржелеза. Так как селективность смолы  зависит от характера противоиона, часто необходимо изменить форму  смолы. Противоионы связаны кулоновскими силами взаимного притяжения с ионообменными  группами и экранируют их заряд. Это  притяжение зависит от физической природы  противоиона, размеров, формы, плотности  электронных оболочек. Одни противоионы  при равенстве концентраций могут  замещать в ионообменнике другие. Ниже приведены ряды противоионов в  порядке убывающей активности и  уменьшения сродства к ионообменной смоле.

HSO₄^- > ClO₃^- > NO₃^- > Br^- > CN^- > НСО₃^- > СН₃СОО^- > OH^- > F^-

Ва²⁺ > Pb²⁺ > Са²⁺> Ni²⁺ > Cd²⁺ > Со²⁺ > Zn²⁺ > Mg²⁺ > Ag⁺ > Cs⁺ > Rb⁺ > K⁺ > NH₄²⁺ > Na⁺ > H⁺ > Li+

M4+ > M³⁺ > M²⁺ > M1⁺

Наиболее  быстрый метод превращения анионита в форму, которая в ряду селективности  стоит выше исходной, состоит в  промывании ее четырехкратным объемом  1 М раствора соответствующей соли. Если для работы необходима форма слабее исходной, то ее сначала переводят в гидроксильную форму, промывая 20-кратным количествам 1 М раствора NaOH, а затем уже превращают в нужную форму. Катеониты переводят в требуемую форму промыванием 1 М раствором нитрата соответствующего металла.