Ионообменная хроматография в фармацевтическом анализе

Методом ионной хроматографии в растворах  для нанесения металлопокрытий  можно определять хром. Можно ожидать, что в дальнейшем этот метод будет  использоваться для анализа таких  частиц, как селенат, ванадат, и частиц, включающих благородные металлы[1,4,7.8].

 

2. Кондуктометрическая катионная хроматография: двухколоночные методы.

Краткое содержание.

Определение катионов проводят в системе, подобной описанной для анализа анионов. В двухколоночной хроматографической системе имеются две колонки - разделяющая и компенсационная. Это обеспечивает высокочувствительное детектирование разделенных катионов в элюенте в виде пиков положительной электропроводности по отношению к фоновому сигналу. Разделяющая колонка содержит смолу на основе сополимера стирола и дивинилбензола с поверхностным слоем сольватированных сульфокислотных групп, обладающим низкой емкостью. Смола для компенсационной колонки представляет собой сильноосновный анионообменник с высокой емкостью.  В качестве элюента при разделении одновалентных катионов обычно используют разбавленную азотную кислоту. Для разделения двухзарядных катионов (например, щелочноземельных металлов) требуется разбавленный раствор азотной кислоты с добавкой хлорида фенилепдиаммония. Анализ катионов в настоящее время ограничивается щелочными металлами, аммонием и щелочноземельными металлами, которые не выпадают в осадок в компенсационной колонке с основной смолой.

Принципы разделения и детектирования

Разделяющая колонка

Катионообменные смолы с низкой емкостью получают путем поверхностного сульфирования сферических частиц стирол-дивинилбензольного сополимера по методике, первоначально описанной Смоллом и сотр. Частицы смолы обрабатывают концентрированной серной кислотой, и на их поверхности образуется тонкий слой сульфокнелотных групп. Окончательная емкость смолы связана с толщиной этого слоя и зависит от типа смолы, диаметра частиц, температуры и времени контакта с серной кислотой. Типичная емкость лежит в интервале 0,065—0,1 мэкв·г^-1 в отличие от 5 мэкв·г^-1 для обычных катионообменников. Смола с катионообменной поверхностью схематически изображена на рисунке (рис 6).

Рис 6. Схема  частиц различных ионообменных смол.

 

Ясно, что  по сравнению с обычной катионообменной смолой длина диффузионного пути в специальной смоле ниже, поскольку неактивная гидрофобная сердцевина смолы ограничивает доступ анализируемых катионов в ее объем. Это приводит к ускорению массообмена катионов и, следовательно, к улучшению качества разделения. Кроме того, благодаря жесткости сердцевины частицы смолы подвергаются меньшему сжатию. Это означает, что можно работать при больших скоростях потока (если противодавление мало), чем в случае обычных смол. Смолы с поверхностными функциональными группами устойчивы при рН 1—4, причем трудности, вызываемые набуханием, незначительны. Селективность поверхностны катионообменных смол по отношению к ионам такая же, как и у обычных смол.

 

Компенсационная колонка

Компенсация электропроводности элюента при  анализе катионов происходит точно так же, как и при определении анионов. Однако вместо катионообменной смолы применяют сильноосновную анионообменную смолу для обмена анионов (или противоионов) элюента и образца на ОН^- ионы. Например, если в разделяющей колонке происходит разделение нитрата натрия и хлорида калия в среде азотной кислоты, то в компенсационной колонке протекают следующие реакции:

1) Элюент : H⁺NCr^- + Смола —ОН^- = Смола — NO^-₃ + H₂O

2) Образец  : Na⁺NO^-₃, K⁺Cl^- + Смола — ОН^- = Смола—NO₃^-, Cl^- + Na⁺OH^-, K⁺OH^-

Таким образом, можно видеть, что взаимодействия в компенсационной колонке приводят к образованию гидроксидов металлов, обладающих высокой электропроводностью, и к элюенту, состоящему в основном из воды. Поскольку функция компенсационной колонки при анализе катионов аналогична рассмотренной для анионов, выбор смолы можно сделать, исходя из тех же соображений. Для этой цели пригодна любая анионообменная смола высокой емкости, если она не влияет на качество разделения, уже достигнутое в разделяющей колонке. Чтобы подавить большую часть побочных воздействий на анализируемые катионы при прохождении их через компенсационную колонку, обычно применяют микропористые смолы типа Dowex 1-X10. Эти смолы с умеренной степенью поперечного сшивания сводят к минимуму неполноту доннановского распределения слабоосновных

омпонентов, таких, как ион аммония, которые в компенсационной колонке со смолой в ОН^--форме превращаются в соответствующие свободные основания. Чем больше объем пор смолы (ниже степень сшивания), тем сильнее проявляется стремление таких частиц к проникновению в твердую фазу. На времена удерживания и, следовательно, на высоты пиков слабых оснований может также влиять степень отработки компенсационной колонки, т. е. степень нейтрализации гидроксилов смолы. Поль и Джонсон сообщили, что смола с 8% сшивающего компонента предпочтительнее смолы с 12% этого компонента, поскольку зависимость высоты пиков от степени отработки компенсационной колонки сводится к минимуму, а эффективность разделения сильноионизированных частиц улучшается. Эти же авторы для повышения точности определения оснований предложили измерять площади пиков, а не их высоты и в особых случаях чаще производить калибровку прибора. Кроме того, важно, чтобы соотношение объемов разделяющей и компенсационной колонок было минимальным: тогда степень разделения, достигнутая в первой колонке, существенно не ухудшится. Сравнение компенсационных колонок размером 50X6 и 100X6 мм показало, что для калия лучшую эффективность разделения обеспечивает колонка меньшей высоты. Число проб, которые можно проанализировать до того, как потребуется регенерация, является функцией емкости и объема слоя компенсационной колонки:

N = Время/t_а

Отработавшую  колонку (в которой активные центры полностью заняты и уже не удаляют анионы элюента) регенерируют, пропуская через нее 0,1 M раствор гидроксида натрия.

Элюенты

Общие соображения, касающиеся выбора элюентов, по существу, те же, что и в анионной хроматографии. Элюенты должны эффективно вымывать анализируемые катионы из разделяющей колонки и вступать в реакции обмена в компенсационной колонке, приводящие к снижению их электропроводности. Выбор элюента зависит от сродства анализируемых катионов к смоле в разделяющей колонке. Для разделения однозарядных катионов эффективными элюентами являются разбавленные (в интервале концентраций 0,001—0,01 н.) растворы минеральных кислот (например, азотной). Двухзарядные катионы (например, щелочноземельных и переходных металлов) значительно сильнее удерживаются на катионообменной смоле, и их уже нельзя вымывать элюентами, пригодными для разделения однозарядных ионов. Несмотря на то что увеличение концентрации минеральных кислот приводит к увеличению вытеснительной способности элюента, концентрированные элюенты обладают более высокой коррозионной активностью и вызывают преждевременное истощение компенсационной колонки. И тем не менее для разделения двухзарядных катионов целесообразнее применять элюенты с более высокой вытеснительной способностью. Уже отмечалось, что лучшие результаты дает нитрат серебра в сочетании с анионообменной компенсирующей колонкой в Сl^--форме. Установлено также, что разбавленные растворы фенилендиаммониевых солей не только более практичны, но и более эффективны. Первоначально использовали n-фенилендиаммониевые соли, которые впоследствии заменили m-фенилендиаммониевыми, поскольку последние обеспечивают лучшее качество разделения.

Пример  определения щелочноземельных металлов и их отделения от щелочных металлов приведен на рисунке, а в таблице указаны стандартные условия для анализа одно- и двухзарядных катионов, рекомендованные фирмой Dionex.

 

 

Рис 7. Отделение  магния, кальция, стронция и бария  от щелочных металлов.

 

 

Таблица 2. Стандартные условия для анализа одно- и двухзарядных катионов.

 

3. Кондуктометрическая катионная хроматография: одноколоночные методы.

Принципы разделения.

Для хроматографического  разделения катионов разработан метод, аналогичный методу одноколоночного разделения анионов. Разделяющая

колонка содержит катионообменную смолу малой  емкости, приготовленную путем ограниченного сульфирования частиц полимерной смолы. Элюент представляет собой разбавленный раствор минеральной кислоты (например, азотной) или этилендиаммониевой соли. Фоновая проводимость такого элюента довольно низка, и поэтому детектор электропроводности можно устанавливать непосредственно после разделяющей колонки, т. е. вторая (компенсационная) колонка не нужна. При прохождении пика электропроводность падает, и поэтому пик является отрицательным. Количество анализируемых ионов данного типа пропорционально высоте пика, характеризующего уменьшение электропроводности. Концентрацию анализируемых ионов находят по линейному калибровочному графику.

Чувствительность этого метода высока: многие катионы можно определять в концентрациях ниже 1 млн^-1. Для разделения катионов щелочных металлов и аммония предпочтительнее разбавленная азотная кислота. Разбавленный раствор нитрата этилендиаммония рекомендуется для разделения катионов магния(II) и других щелочноземельных металлов. Некоторые катионы двухвалентных и редкоземельных металлов удовлетворительно разделяются в среде элюента, содержащего катион этилендиаммония и тартрат-анион либо α-окси-изобутират-анион. Приводится несколько примеров успешного разделения. катионов щелочных и щелочноземельных металлов и аммония в реальных образцах.

 

 

Элюенты.

При разделении ионов щелочных металлов и аммония эффективны элюенты, содержащие ион водорода, например разбавленные растворы азотной или хлорной кислоты. Кислые элюенты не должны содержать ионов двухвалентных металлов, которые могут накапливаться на смоле и «отравлять» колонку. Но такие элюенты неэффективны при разделении смесей катионов двухвалентных металлов, таких, как магний и щелочноземельные металлы. Для разделения щелочноземельных металлов

рекомендуются элюенты, содержащие соли м-фенилендиамина. Авторы добились очень хорошего разделения с м-фенилендиамином в качестве элюента, но столкнулись с некоторыми трудностями, связанными с продуктами окисления элюента, которые сорбируются в начальном слое колонки и с большим трудом удаляются из нее. Элюенты на основе соли этилендиамина обеспечили даже лучшее качество разделения и не изменяли

окраски содержимого  колонки. Эти примеры разделения подробно обсуждаются ниже. Элюенты с этилендиаммониевыми солями даже при разбавлении плохо разделяют ионы щелочных металлов. Таким образом, растворы нитрата этилендиаммония пригодны для разделения смесей ионов двухвалентных металлов, а разбавленный раствор азотной кислоты — ионов одновалентных металлов. В элюент, содержащий этилендиаммониевый катион, можно ввести комплексообразующий анион, например тартрат и оксиизобутират.

 

Разделение  на основе различий в образовании  комплексов.

Рассмотренные до сих пор разделения катионов осуществляются благодаря  различиям в сродстве разных ионов  к катионообменнику. Число катионов металлов, разделяемых с помощью  традиционной ионообменной хроматографии, довольно ограниченно. Дополнительные возможности метода связаны с применением элюентов, обладающих избирательной комплексообразующей способностью. Первые шаги в этом направлении уже сделаны. В этом разделе приводятся примеры разделения катионов различных металлов в среде элюента, содержащего катион этилендиаммония и тартрат-анион или а-оксиизобутират-анион[1,4,7.8].

 

4. Кондуктометрическая анионная хроматография: одноколоночные методы.

Процесс хроматографического разделения.

В конце  1978 г. в Университете шт. Айова (США) была разработана простая хроматографическая методика разделения ряда распространенных ионов. В этой новой системе для анионной хроматографии имеется анионообменная разделяющая колонка, присоединенная непосредственно к детектору электропроводности, а компенсационная колонка не требуется. В системе применены два принципиальных новшества:

1) специальная  анионообменная смола с очень  малой емкостью (0,007—0,040 мэкв.*г^-1);

2) элюент, обладающий  очень низкой электропроводностью.  Элюенты представляют собой водные  растворы натриевых, калиевых  или аммониевых солей бензойной,  фталевой и о-сульфобензойной кислот с концентрацией (l÷5)*10^-4 M. Все это позволило добиться очень быстрого разделения анионов, и ни в одном случае отсутствие компенсационной колонки не помешало анализу.

Успеху нового метода способствовал и подбор такого элюента, анион которого сильно удерживается смолой.

На рис. 8 представлена блок-схема одноколоночного ионного хроматографа. Он включает следующие компоненты:

1) насос для  подачи элюента через пробоотборную  петлю, колонку и кондуктометрическую  ячейку со скоростью 0,8—2,0 мл/мин;

2) кран для  ввода пробы и пробоотборную  петлю, позволяющую вводить пробу  объемом 100 мкл;

3) разделяющую  колонку с внутренним диаметром  2,0—3,0 мм и длиной 500 мм, заполняемую однородными мелкими частицами анионообменной смолы [смола приготовляется на основе сорбента XAD-I фирмы Rohm and Haas; она обладает емкостью 0,007— 0,040 мэкв.*г^-1];

4) проточную  кондуктометрическую ячейку, являющуюся  частью детектора электропроводности, для непрерывной регистрации  проводимости элюата;

5) самописец  для регистрации выходного сигнала детектора электропроводности.

Рис 8. Блок-схема одноколоночного ионного хроматографа.

 

Одноколоночный  метод позволяет осуществить  быстрое разделение анионов, причем отсутствие компенсационной колонки  никогда не затрудняет анализа. На рис. 8 приведен пример хроматографического разделения четырех анионов на колонке с анионообменной смолой емкостью 0,007 мэкв-г-1. Смесь элюировали 1,0-10-4 M фталатом калия при рН 7,1. Хлорид, нитрат, тиоцианат и нодид появляются после «ложного» пика (происхождение которого обсуждается ниже). На рис. 8 приведен пример быстрого разделения хлорида, нитрата и сульфата. Емкость смолы составляет 0,04 мэкв-г-1, а в качестве элюента пользовались 5,0-10-4 M фталата калия при рН 6,2. Если провести анализ пяти образцов, содержащих постоянное количество ионов хлора и нитрата, но разное количество сульфата (2,75—13,75 млн-1), то получим несколько хроматограмм. График зависимости высоты пика сульфата от его концентрации дает прямую линию.