Ионообменная хроматография в фармацевтическом анализе

В первых кондуктометрических детекторах применялись  платиновые электроды, покрытые платиновой чернью. Такие электроды имеют  большую площадь поверхности (и  емкость) и низкое сопротивление  поляризации. Однако поток жидкости стремится смыть покрытие с электродов и изменить их характеристики. В  ячейках новейших детекторов электропроводности электроды, как правило, делают из нержавеющей  стали марки 316. Мертвый объем ячеек не превышает 2 мкл. Чтобы «дезактивировать» новую ячейку и стабилизировать сигнал, ее промывают 50%-ным раствором азотной кислоты в течение нескольких минут.

Подвижность ионов в растворе меняется с температурой. Электропроводность большинства растворов  ионов возрастает примерно на 2% при  увеличении температуры на 1°С. В  детекторах электропроводности изменение  температуры можно скомпенсировать  с помощью термистора и компенсационной  схемы, в которой сопротивление  линейно меняется с изменением температуры  раствора. В любом случае ячейку детектора нужно изолировать, чтобы  предотвратить случайные колебания  ее температуры. Полезно, но не обязательно  изолировать и другие части ионного  хроматографа, такие, как колонки  и емкости с элюентом.

Пространство  ячейки, в котором измеряется температура, обычно достаточно велико, и поэтому  в нем возможно заметное перемешивание  разделенных фракций. При работе с двумя последовательно установленными детекторами во избежание размывания хроматографической полосы детектор электропроводности лучше помещать  последним.

Все кондуктометрические  детекторы должны включать какие-либо средства компенсации фонового сигнала, который может на три порядка  величины превышать сигнал от образца. Для проточной сравнительной  ячейки компенсация может оказаться  гораздо более затруднительной, чем для непроточной. В большинстве  удачно сконструированных детекторов фоновый сигнал компенсируется с  помощью электронной схемы и  потому применяют только одну проточную  ячейку[1,4,7.8].

 

4. Методы ионообменной хроматографии.
1. Кондуктометрическая анионная хроматография: двухколоночные методы.

Принципы разделения и детектирования.

Описание прибора.

В ионной хроматографии используются принципы высокоэффективной жидкостной хроматографии. Ионный хроматограф состоит из резервуаров  для элюента, насосов, крана для  ввода пробы, колонок, кондуктометрического детектора и самописца. Блок-схема  прибора для анализа как катионов, так и анионов (рис 3).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис 3. Блок-схема  прибора для анализа катионов и анионов.

 

Легко видеть, что благодаря применению двух колонок  этот ионный хроматограф необычен. Следует также отметить, что, за исключением  насоса и кондуктометрической ячейки, в ионной хроматографии используют только химически инертные соединительные трубки, колонки и краны. Это позволяет  применять сильнокислые и сильноосновные элюенты, которые могли бы вызвать значительную коррозию в обычных хроматографических системах. Допустимое для ионного хроматографа давление не превышает 1000 фунт/кв. дюйм (60 МПа). В первых ионных хроматографах предусматривалось поочередное определение анионов или катионов в соответствующих системах. Современные приборы снабжаются двумя системами детектирования и несколькими насосами. Это позволяет одновременно анализировать катионы и анионы, а также разделять анионы сильных и слабых кислот. В ионных хроматографах предусмотрена также возможность автоматического регенерирования отработавших компенсационных колонок. Продолжительность регенерации и промывки можно задавать соответствующими переключателями.

Разделяющая колонка.

Обычные ионообменные смолы готовят путем хлор-метилирования сферических частиц сополимера стирола с дивинилбензолом и последующего аминирования. Для большинства смол реакция протекает полностью с образованием обменника с высокой емкостью. В колонках, заполненных обычными анионообменниками с высокой емкостью, скорость разделения может лимитироваться диффузией ионов в объеме частиц смолы и обратно, а также обменными реакциями в смоле. В результате медленного массопереноса и размывания зоны для некоторых колонок наблюдается общая потеря эффективности. Повышения как скорости разделения, так и эффективности колонки достигают путем увеличения скорости переноса. В случае разделяющих колонок фирмы Dionex этого удалось добиться благодаря применению поверхностно-пористых анионообменных смол. Для высокоэффективной жидкостной хроматографии. Такие смолы готовят, нанося на стерическую частицу стиролдивинилбензольного сополимера тонкий слой анионообменного латекса. Затем осуществляют поверхностное сульфирование мелких частиц, так что внешняя оболочка частиц смолы представляет собой тонкий слой сульфогрупп. Потом однородные по размеру частиц смолы (0,1—0,5 мкм) переводят в анионообменную форму, обрабатывая их четвертичным анионообменным материалом. Под действием электростатических сил мелкие частицы латекса притягиваются к поверхности смолы и образуют вторую тонкую оболочку вокруг ядра частиц. Таким образом, получающаяся смола состоит из трех различных слоев: внутреннего ядра, сульфированного слоя и слоя анионообменных частиц. На рисунке схематически изображены частицы различных ионообменных смол (рис 4).

Рис 4. Схема  частиц различных ионообменных смол.

 

Преимущество  поверхностно-пористых смол перед обычными ионнобменниками состоит в резком снижении диффузионного пути, что  приводит к ускорению обмена, или  массопереноса, ионов элюентаи образца  и, следовательно, к значительному  увеличению эффективности колонки. В отличие от других поверхностно-пористых материалов с сердцевиной из силикагеля или стекла смолы, применяемые в системах фирмы Dionex, очень стабильны даже в среде сильноосновных элюентов. Несмотря на то что анионообменный материал, наносимый на смолу, обладает высокой емкостью, общая емкость ионного обмена смолы низка и обычно составляет 0,02—0,05 мэкв.*г^-1. Поверхностно-пористая структура и малая емкость .смолы позволяют разделять разнообразные анионы в среде сравнительно разбавленных элюентов. Кроме того, благодаря малому диффузионному пути эффективность колонки с такой смолой меньше подвержена влиянию скорости потока. Это означает, что можно выбирать относительно большие скорости и быстрее проводить анализ. Разделяющие колонки фирмы Dionex по селективности сравнимы с колонками, наполненными обычными смолами. Порядок изменения сродства к различным анионам зависит не только от природы активных групп на поверхности смолы, но и от других факторов, таких, как диаметр гидратированных групп, основность, заряд и структура.

 

Компенсационная колонка.

Как уже  говорилось, компенсационная колонка  нужна для обмена катионов элюента  и образца на ионы водорода. Она  обеспечивает снижение фоновой проводимости элюента и перевод анализируемых  анионов в кислоты, обладающие высокой  электропроводностью. Компенсационную  колонку можно заполнять любой  сильнокислой катионообменной смолой, поскольку она эффективно поглощает  катионы элюента и не влияет на качество разделения, уже достигнутое  в первой колонке. Накопление катионов образца и элюента продолжается до тех пор, пока все активные центры не будут заблокированы ими и  смола практически целиком не перейдет в натриевую (или калиевую) форму. Колонку регенерируют, прокачивая через нее 0,25 н. раствор серной кислоты. Благодаря закону действия масс ионы водорода серной кислоты вытесняют  ионы натрия из смолы и переводят  ее в первоначальную Н⁺-форму. Во избежание частой регенерации компенсационной колонки желательно, чтобы емкость слоя смолы в ней была как можно большей. Ориентировочное число образцов, которое можно проанализировать до регенерации компенсационного слоя, выражается урвнением

N = V_BC_B/(V_AC_AK^х_у)

где V_A — объем разделяющего слоя, V_B — объем компенсационного слоя, C_A — емкость разделяющего слоя, С_А — емкость компенсационного слоя, K^х_у — коэффициент селективности анализируемого аниона X, сильнее всего удерживаемого разделяющей колонкой, по отношению к аниону элюента Y. 

Наряду  с большой емкостью компенсационной  смолы выгодно иметь как можно  больший объем компенсационного слоя. Однако во избежание размывания хроматографических зон и, следовательно, потери эффективности в результате перераспределения анализируемых  ионов в свободном пространстве компенсационной колонки отношение V_B/V_A должно быть небольшим. Важно, чтобы величина K^х_у была (в пределах разумного) как можно меньше. При слишком больших значениях K^х_у требуется элюент с высокой концентрацией, что в свою очередь сократит время нормальной работы компенсационной колонки. Однако, если K^х_у слишком мало, т. е. сродство элюирующего аниона Y к разделяющей смоле слишком велико, можно ожидать ухудшения качества разделения анализируемых частиц.

Уравнение, возможно, дает более приемлемый способ выражения времени работы прибора  между циклами регенерации:

Здесь емкость  и количество смолы относятся  к компенсационной колонке. Можно  видеть, что время работы может  существенно меняться в зависимости от параметров колонки и элюента. В обычных условиях анализа компенсационная колонка не отрабатывается после 8 ч непрерывной работы, а в некоторых случаях ею можно непрерывно пользоваться в течение 36 ч.

Число образцов, которое молено ввести в прибор между  циклами регенерации, выражается уравнением

N = Время/t_а

где t_a — время одного анализа. Для непрерывной работы фирма Dionex выпускает систему с двумя компенсационными колонками, одна из которых регенерируется, в то время как вторая находится в работе.

 

 

Элюенты.

Элюенты, предназначенные для двухколоночной системы, должны отвечать двум основным требованиям. Во-первых, они должны вытеснять анионы из разделяющей  колонки. Во-вторых, они должны вступать в реакции обмена в компенсационной  колонке с образованием воды или  других слабодиссоциирующих частиц, обладающих низкой проводимостью. Второе требование уже обсуждалось выше.

В идеале элюирующий анион Y должен иметь несколько большее сродство к разделяющей смоле, чем наиболее прочно удерживаемый анализируемый анион X. Тем не менее такой элюент может не обеспечить анализ сложной смеси слабоудерживаемых анионов, таких, как фторид, хлорид, нитрит и т. д.; они могут дать один пик. Напротив, этот же элюент может позволить разделить более прочно удерживаемые частицы, например SO₄^2-, SCN^- и S₂O₃^2- . Поэтому выбор элюента существенно зависит от числа и типа анализируемых частиц. С помощью элюента промежуточной силы часто добиваются хорошей селективности для ряда анионов с различным сродством. Способность такого элюента к вытеснению ионов можно оптимизировать, меняя его концентрацию. Список элюентов, пригодных для разделения анионов с широко меняющимся сродством (таб. 1).

 

Таблица 1. Элюенты для анализа анионов.

Элюенты, содержащие тетраборат натрия, обладают очень низкой способностью к вытеснению и применяются редко. Однако они  полезны в случае разделения быстро элюируемых частиц, таких, как фторид, формиат и ацетат. Борат натрия в результате конверсии в компенсационной  колонке дает слабодиссоциирующую  борную кислоту.

Элюент, содержащий гидроксид натрия, с точки  зрения компенсации фонового сигнала  является идеальным, поскольку он конвертируется в воду. Недостатком же этого элюента  является его низкое сродство к разделяющей  смоле, что обеспечивает вытеснение только слабоудерживаемых анионов. Увеличение концентрации гидроксида натрия в растворе увеличивает его способность  к вытеснению, но вызывает быструю  отработку компенсационной колонки. Гидроксид натрия иногда добавляют  к некоторым элюентам, таким, как  растворы бикарбоната и карбоната  натрия. В определенных ситуациях  это может принести пользу, например при определении фосфата, который  при низких значениях рН элюируется раньше сульфата, а при высоких  значениях рН — позже. Трехвалентный  фосфат-анион удерживается смолой сильнее, чем двухвалентный.

 

Металланионные образцы.

Методом ионной хроматографии часто удается  анализировать металлы, которые  либо присутствуют в образце в  виде анионов, либо образуют анионы в  щелочной среде. Фиклин  для получения  измеримых количеств вольфрамата  и молибдата, присутствующих в природных  водах в концентрациях до 1 мкг/л, предварительно концентрировал их на хелатной смоле. Разделение этих металлов было осуществлено в стандартной  анионной разделяющей колонке (в  качестве элюента использовался  0,006 M раствор карбоната натрия). Определение малых количеств бора в виде тетрафторборатного комплекса провели Хилл и Лаш после предварительного накопления на смоле, избирательной к бору (рис 5).

Рис 5. Определение  тетрафторбората в элюенте 0,003М  NaHCO₃/0.004М Na₂CO₃ на разделяющей колонке типа L-20 размером 500*3 мм.

 

Мышьяк-содержащие образцы успешно определяли с  помощью ионной хроматографии при  использовании в качестве элюента смеси карбоната и гидроксида натрия_. Этот элюент эффективен для определения частиц AsO^3-₄

и мышьяка (III) после его окисления в AsO^3-₄. Полученные результаты хорошо согласуются с данными рентгеноструктурного анализа. Анализ мышьяк содержащих неорганических и органических соединений в образцах естественного происхождения провели также Шепард и сотрудники. Они подсоединили ионный хроматограф к атомно-абсорбционному спектрометру, специфичному к мышьяку и включавшему систему получения гидридов.