Ионообменная хроматография в фармацевтическом анализе

 

 

 

 

Таблица 6. Схема очистки МДГ из Sphaerotilus natans штамм Д-507 в условиях миксотрофного роста.

 

Сравнение результатов гель-хроматографии  и электрофореза с додецилсульфатом натрия показывает, что МДГ из Sphaerotilus natans штамм Д-507 в условиях миксотрофного роста представлена двумя изоформами - изологическим димером и тетрамером.

Рис. 11. Электрофореграммы МДГ, очищенной из S. natans при миксотрофном росте: 1-специфическое проявление; 2-окрашивание нитратом серебра

Рис. 12. Ds-Na-электрофорез МДГ из S. natans: 1-фосфорилаза b, 2-БСА, 3-

овальбумин, 4-карбоангидроза, 5-ингибитор трипсина, 6-лизоцим, 7-исследуемая МДГ

 

Т.о., с помощью метода ионообменной хроматографии добились разделения изоформ малатднгидрогеназы из серобактерий Sphaerotilus natans штамм Д-507. Показано, что МДГ при миксотрофном росте бактерий представлена изологическим димером и тетрамером, выполняющими различные функции[2].

 

 

5.3. Применение ионообменной хроматографии для очистки аконитатгидратазы из миокарда крысы в условиях нормы и при индукции апоптоза.

Введение

В норме фактор некроза опухоли-а (ФНО-а) играет фундаментальную физиологическую  роль в иммунорегуляции. Синтез и  секрецию ФНО-а клетками иммунной системы  и другими клетками индуцируют липосахариды и другие компоненты микроорганизмов, вследствие этого его уровень возрастает при инфицировании или поступлении в организм бактериальных эндотоксинов. Кроме того, ФНО-а принимает участие в регуляции апоптоза клеток. Но в некоторых случаях, ФНО-а проявляет многочисленные системные и локальные эффекты, многие из которых могут играть важную роль в развитии патологии миокарда.

Обладая способностью индуцировать апоптоз, ФНО-а также способен вызвать  генерацию в клеточной мембране активных форм кислорода (АФК), что приводит к активации процессов свободнорадикального окисления (СРО) и высвобождению каталитически активных ионов Fe²⁺ из вне- и внутриклеточных депо. Снижение внутриклеточного уровня Fe²+ может достигаться за счет увеличения содержания цитрата. В этой связи интерес вызывает изучение особенностей функционирования ферментов, ответственных за накопление и утилизацию цитрата и прежде всего, аконитатгидратазы.

Аконитатгидратаза (АГ; КФ. 4.2.1.3) - фермент, катализирующий реакцию обратимой  изомеризации цитрата в изоцитрат. Общеизвестен факт O₂^--индуцируемого подавления активности АГ, что позволяет рассматривать данный фермент в качестве чувствительной мишени действия АФК в условиях интенсификации СРО.

Целью данной работы явилась разработка способа очистки АГ из миокарда крысы  в условиях нормы и при индукции апоптоза ФНО-а с помощью гель-фильтрации на сефадексе G-25, ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе и гель-хроматографии на Toaypearl HW-65.

Материалы и методы.

В качестве объекта исследования использовали белых лабораторных крыс, содержавшихся  на стандартном рационе вивария. Сердце извлекали у самцов, массой 200-250 г. Для индукции апоптоза животным вводили актиномицин D внутрибрюшинно в дозе 20мкг на кг веса животного, через 20 минут вводили ФНО-а (1 мкг/кг). Материал для исследований забирали на 12-й час после введения ФНО-а. Активность фермента определяли спектрофотометрически при 233 нм в среде следующего состава: 50мМ трис-HCl буфер (pH 8), содержащий 0,6мМ цитрат. О скорости АГ-реакции судили по возрастанию оптической плотности в ходе катализируемого ферментом превращения цитрата в цис-аконитат. За единицу активности (Е) АГ принимали количество фермента, катализирующее превращение 1 мкмоль субстрата в 1 мин при 25°С. Определение белка проводили по методу Лоури.

Очистка АГ из нормального и патологически  измененного миокарда крысы включала несколько этапов. Навеску ткани  гомогенизировали в фарфоровой ступке в 4-кратном объеме охлажденной среды  выделения следующего состава: 50мМ трис- HCl буфер (pH 7,8), содержащий 1мМ ЭДТА и 2% В-меркаптоэтанол. Гомогенат фильтровали и центрифугировали при 7000g 10 мин. Полученный супернатант подвергали фракционированию сульфатом аммония в границах насыщения 40-65%. Кристаллический сульфат аммония добавляли в количестве, соответствующем нижней границе насыщения. Смесь центрифугировали при 10000g в течение 15 мин. Затем к надосадочной жидкости добавляли сульфат аммония в количестве, соответствующем верхнему пределу насыщения. После центрифугирования при 15000g в течение 10 мин получали осадок, содержащий АГ. Полученный осадок растворяли в минимальном объеме исходной среды выделения.

Освобождение от низкомолекулярных  примесей осуществляли с помощью  гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-25 (1,4 х 20 см). Ферментный препарат наносили в количестве не более 20-25% от объёма колонки. В качестве среды эллюции для АГ использовали 10мМ трис-HCl буфер (pH 8,0), содержащий 0,1 мМ ЭДТА и 1% В-меркаптоэтанол. Кроме этого, в среду эллюции добавляли 10мкМ Fe²+, что предотвращало потерю активности фермента в ходе гель-фильтрационной хроматографии на G-25 вследствие изменения исходной структуры Fe-S-кластера в активном центре АГ. Скорость эллюции составляла 20-25мл/час.

Дальнейшую очистку фермента проводили  с помощью ионообменной хроматографии  на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой (1,2 х 13 см). Среда эллюции имела тот  же состав, что и буфер, используемый на предыдущей стадии. После сорбции  белка на колонке проводили десорбцию  фермента с помощью ступенчатого градиента KCl в той же среде эллюции. Колонку промывали 100мМ KCl (20 мл), что позволяло достичь удаления сопутствующих белков на данной стадии. Фермент десорбировался при использовании 200мМ KCl. Скорость эллюции составляла 20-25 мл/час.

Завершающим этапом очистки была гель-хроматография  на колонке с Toaypearl HW-65 (2,2х65см). Ферментный препарат наносили в количестве не более 1-3% от общего объема колонки. Эллюцию проводили со скоростью 20мл/час средой того же состава, что и на предыдущих стадиях.

Все этапы выделения и очистки  фермента осуществляли при температуре 0-4°С. Разработанный способ очистки позволил получить ферментативные препараты АГ из сердца крыс в условиях нормы и при индукции апоптоза, которые были использованы для изучения некоторых физико-химических свойств фермента.

Опыты проводили в 3-4-кратной биологической  повторности, аналитические определения  в каждой пробе - в 2-х повторностях. Статистическую обработку данных проводили  на IBM PC/AT с использованием программы “Stadia”.

Результаты и их обсуждение.

В результате 127- и 134-кратной очистки  были получены препараты АГ из нормального  и патологически измененного  миокарда крысы, с удельной активностью 30,4 и 17,4 Е на мг белка, выходом 12,6 и 13,0%, соответственно (табл. 7). Необходимо отметить, что в гомогенате сердца крыс, подвергнутых воздействию ФНО-а наблюдалось снижение удельной активности АГ в 1,8 раза, относительно данного показателя в условиях нормы. Можно предполагать, что такое снижение удельной активности АГ при введении ФНО-а, связано с интенсификацией процессов свободнорадикального окисления, и следовательно, с разрушением железо-серного кластера данного фермента свободными радикалами, содержание которых увеличивается при патологии миокарда (рис. 13).

Рис. 13. Удельная активность аконитатгидратазы в миокарде крысы контрольной группы (1) и при введении ФНО-а (2).

Таблица.7. Очистка аконитатгидратазы из миокарда крысы в норме и при индукции апоптоза ФНО-а

 

В ходе ионообменной хроматографии  на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой фермент  десорбировался в виде одного пика. Причем, фермент, как из нормального, так и из патологически измененного  миокарда десорбировался с носителя при одной и той же концентрации KCl (200мМ). Данная стадия позволила освободить ферментный препарат от значительного количества сопутствующих белков. В ходе ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе степень очистки возрастала в 6 раз. Применение гель-хроматографии на колонке с Toaypearl HW-65 не только способствовало увеличению степени очистки, но также и позволило определить молекулярную массу фермента. Установлено, что при развитии апоптоза не происходит изменения молекулярной массы АГ, которая составляет 50,0 ± 5,0 кДа.

Изучение зависимости скорости реакции от концентрации ионов Н+ показало, что АГ, как в условиях нормы, так и при патологии  проявляет активность в диапазоне  значений рН от 6 до 9. Выявленный оптимум  рН АГ из нормального миокарда равен 8,0. АГ из патологически измененного  миокарда проявляла максимальную активность при рН 7,8 (рис.14).

Рис. 14. Зависимость скорости АГ-реакции  от концентрации ионов водорода в  условиях нормы (7) и при индукции апоптоза (2)

 

Заключение.

Таким образом, с помощью процедур выделения, включающих гель- хроматографию  на ДЭАЭ-целлюлозе и на Toaypearl HW-65, в результате 127- и 134- кратной очистки были получены ферментные препараты АГ из миокарда крысы в норме и при патологии, с удельной активностью 30,4 и 17,4 Е на мг белка соответственно, что позволило изучить некоторые физико-химические свойства фермента[5].

5.4. Особенности сорбции этаналя полифункциональным анионообмеником.

Введение.

Рынок производства различных лекарственных  форм на водно-спиртовой основе постоянно  расширяется, и, следовательно, возрастают требования к их качеству. На этапе  изготовления таких фармацевтический препаратов, как настойки, экстракты  и т.п., необходимо особое внимание уделять  качеству исходных продуктов. Так, настойки готовят на основе биологически активных веществ и водно-этанольных растворов  с процентным содержанием этилового  спирта от 40 до 70 %. Одной из распространенных нежелательных примесей в спирте является этаналь, поэтому остается актуальной проблема извлечения данного  продукта из водно-спиртовых растворов  на фармацевтических производствах.

Целью настоящей работы является исследование особенностей сорбции этаналя из водно-спиртовых растворов на полифункциональном анионообменнике РА 511.

 

Теоретическая часть.

Анионообменные полимерные сорбенты традиционно используются для выделения  из растворов минеральных ионов  или органических электролитов.

Механизм сорбции таких веществ  обусловлен, в основном, ионным обменом. В настоящей работе исследована  возможность сорбции на ионообменниках таких неионизированных органических соединений, как карбонильные. Сорбция  веществ данного класса не может  происходить за счет обменного механизма, а доля необменной физической сорбции  сравнительно мала. Было установлено, что извлечение альдегидов на слабоосновных анионообменниках происходит за счет химической сорбции.

Ранее были исследованы особенности поглощения этаналя из водно- этанольных растворов на монофункциональном ионообменнике D 309, где в качестве ионогенной группы выступал первичных амин. В настоящей работе рассмотрен процесс сорбции альдегида на слабоосновном анионообменнике с полиаминами в качестве функциональных групп.

Эксперимент.

Объектом исследования был выбран слабоосновный анионообменник РА 511, физико-химические характеристики которого представлены в табл. 8.

 

Таблица 8. Физико-химические характеристики ионообменника РА 511

Методом потенциометрического титрования установлен характер функциональных групп  ионообменника. Кривые титрования снимали методом многих навесок.

Процесс поглощения этаналя анионообменником изучали в статических и динамических условиях.

Кинетические кривые сорбции на исследуемом ионите получали методом  ограниченного объема в статических условиях. Навеску анионообменника РА 511 в ОН-форме приводили в контакт с 200 см³ водно-спиртового раствора этаналя. Исходная концентрация раствора альдегида составила 810^-3 моль/дм³. Через определенные промежутки времени из раствора отбирали пробу (аликвота не превышала 0,5 % от всего объема раствора) и определяли содержание этаналя фотоколориметрическим методом. Контроль количества сорбированного альдегида устанавливали по разности концентрации растворов в начальный момент времени и после контакта с ионообменником.

Для исследования сорбции этаналя  в динамических условиях применяли  стеклянные колонки диаметром 0,83 см с неподвижным слоем анионообменника (раствор пропускался сверху вниз). Объем загрузки смолы составил 10 см³. Концентрация исходного водно-спиртового раствора этаналя - 110^-3 моль/дм³. Через колонку пропускали раствор со скоростью 1,1 см³/мин, отбирая фракции фильтрата по 100,0 см . Процесс продолжали до тех пор, пока концентрация этаналя в фильтрате не оставалась постоянной.

Для подтверждения механизма сорбции  были получены ИК-спектры для анионообменника  РА 511 в ОН- и альдегидной формах. Спектры записывали на приборе VERTEX-70 в интервале частот 4000-400 см^-1 в режиме пропускания. Образцы готовили в виде таблеток с бромидом калия.

 

Обсуждение результатов

Характер функциональных групп  исследуемого сорбента был определен  методом потенциометрического титрования (рис.15)

Рис. 15. Кривая потенциометрического титрования анионообменника РА 511.

 

Константы основности анионита рассчитаны по уравнению Гендерсона- Гассельбаха:

где K; - константа ионизации функциональных групп ионообменника; n - параметр, связанный с электростатическим взаимодействием функциональных групп; а - степень ионизации сорбента.

Участки кривых потенциометрического титрования между двумя точками  перегиба, обработанные в координатах  уравнения Гендерсона - Гассельбаха, позволяют определить значения кажущихся  констант диссоциации функциональных групп ионита. Для анионообменника  РА 511 они составили соответственно: рК_Ь1= 5,75; рК_Ь2=7,04; pK_b3=9,71. Таким образом, можно говорить о слабоосновных свойствах полиаминов в ионите.

Экспериментально полученная кинетическая кривая сорбции этаналя из водно-спиртового раствора представлена на рис. 16. Емкость ионообменной смолы по этаналю в данных условиях составила 0,51 ммоль/г_сух.