Ионообменная хроматография в фармацевтическом анализе

 

Ионообменные смолы.

В настоящее  время уже имеются ионообменники, представляющие собой органические вещества с четвертичными аммониевыми  функциональными группами, химически  связанные с поверхностью пористого  силикагеля. Это дает возможность  получить тонкую оболочку ионообменного  материала, окружающую частицы силикагеля. В качестве наполнителя колонок  для разделения анионов успешно  применяется анионообменник с фирменным  наименованием Vydac SC. Сферические частицы этого наполнителя имеют диаметр от 30 до 44 мкм, а обменная емкость материала составляет примерно 0,1 мэкв.*г^-1. Порядок элюирования анионов несколько другой, чем в случае органических анионообменников. Так, на анионообменнике Vydac SC нитрат элюируется позже сульфата и бромида. Ион фтора не дает сигнала, вероятно, из-за адсорбции на матрице силикагеля.

 

Рис 9. Разделение хлорида, бромида, нитрата и сульфата на ионообменнике Vydac IC.

Рис 10. Разделение ацетата (1) и формиата (2) на ионообменнике Vydac IC.

 

Недавно был получен более эффективный  ионообменннк Vydac 302 IC. Он представляет собой наполнитель на основе силикагеля, обладающего высокой механической прочностью, с диаметром частиц около 15 мкм. Его удельная поверхность  составляет 86м²*г^-1, а средний диаметр пор равен 330А. На рис. 9 и 10 представлены хроматограммы, полученные с применением этого ионообменника.

 

Анионообменники.

Смолы XAD-I, XAD-2 и XAD-4 фирмы Rohm and Haas являются поперечно сшитыми сополимерами стирола и дивинилбензола с высокой плотностью поперечных связей и обладают необычными физическими свойствами. Они имеют макросетчатую структуру и сохраняют ее даже после дегидратации. Каждая частица смолы представляет собой конгломерат сплошных микросфер, между которыми расположены поры и каналы. Эти смолы служат исходным материалом для приготовления анионообменников с малой емкостью обмена, пригодных для анионной хроматографии. Наиболее эффективные смолы для ионной хроматографии получены на основе смолы XAD-I с наименьшей удельной поверхностью (100 м²*г^-1) и наибольшим средним диаметром пор (250 А) из смол серии XAD.

В мягких условиях получаются анионообменные смолы  с разной, но всегда малой емкостью обмена.

 

Влияние pH элюэнта.

Чаще  всего применяемые элюенты содержат соль либо бензоата, либо фталата. Обычно величину рН элюента устанавливают  в интервале 5,8—6,8, что близко к  естественному значению рН раствора соли бензойной или фталевой кислоты. Если рН элюента значительно увеличить, то в нем появится еще один анион  — гидроксил. Такой элюент затрудняет анализ, поскольку при работе с  ним появляются дополнительные положительные  либо отрицательные пики до пиков  определяемых анионов или после них.

Если  элюент сделать более кислым, то элюирующая сила снизится, так как  часть элюирующих анионов перейдет либо в молекулярное состояние (например, бензоат в бензойную кислоту), либо в анион с меньшим зарядом. Бензойная кислота сама является хорошим элюентом, но при разбавлении она лишь частично диссоциирует, и поэтому ее эффективная элюирующая сила ниже, чем для ее соли при той же самой концентрации.

Несмотря  на то что рН образца может отличаться от рН выбранного элюента, объем пробы  настолько мал (обычно 100 мкл), что  образец быстро достигает величины рН элюента. В зависимости от рН среды  некоторые анионы будут существовать в разных формах. Карбонат можно перевести в бикарбонат или угольную кислоту. Цианид может существовать в виде аниона только в щелочной среде, и поэтому для его отделения и детектирования необходим основной элюент[1,4,7.8].

Для изменения  времени удерживания определенных анионов относительно других может  оказаться полезным регулирование  рН элюента.

5. Применение ионообменной хроматографии.

5.1. Применение ионообменных смол в сорбционной очистке этанола от микропримесей.

 

В настоящее  время к качеству этилового спирта, используемого в пищевой промышленности и медицине, предъявляются всё более возрастающие требования, что вызывает необходимость дальнейшего совершенствования процессов очистки, позволяющих осуществлять практически полное выделение примесей, отрицательно влияющих как на здоровье человека, так и на качественные показатели продукции.

В России пищевой этанол получают перегонкой и ректификацией сброженного крахмал- и сахарсодержащего сырья (рожь, пшеница, кукуруза, меласса и пр.). Примеси, сопутствующие этиловому спирту, отличаются большим разнообразием, их состав и концентрация в продуктах и полупродуктах спиртового производства определяются многими факторами: видом и качеством исходного сырья, работы варочного, бродильного, отделений, применяемой схемы брагоректификации и т.д., поэтому очистка этанола ректификационными методами представляет собой архисложную задачу. Между тем, многие доступные физико-химические способы выделения примесей из растворов (мембранная сепарация, адсорбция, ионный обмен и т.д.) до сих пор остаются невостребованными спиртовой промышленностью, хотя часть из них находят широкое применение в других отраслях. Задача настоящего исследования – оценка эффективности применения ионообменных смол для сорбционной очистки этилового спирта. Сущность ионного обмена заключается в обратимом процессе эквивалентного (стехиометрического) обмена молекулами между раствором и ионообменником.

 

 

Таблица 3. Марка и тип сорбентов.

1	Tulsion A-2 XMP	слабоосновный анионит
2	Tulsion A-8 XMP	слабоосновный анионит
3	Tulsion A-10 XMP	слабоосновный анионит
4	Tulsion A-20 Cl-	слабоосновный анионит
5	Tulsion A-23 Cl-	сильноосновный анионит
6	Tulsion A-23 P	сильноосновный анионит
7	Tulsion A-26 Gel	сильноосновный анионит
8	Tulsion CXO-12	слабокислотный катионит
9	Tulsion T-42 MP	сильнокислотный катионит
10	Tulsion T-42 Na+	сильнокислотный катионит
11	Tulsion T-46 H	сильнокислотный катионит
12	Tulsion T-52 H	сильнокислотный катионит
13	Tulsion T-57	сильнокислотный катионит
14	Ку-2	сильнокислотный катионит
15	Cорбент из фильтра «Аквафор»	нет данных

 

В ходе эксперимента проводили очистку пищевого этанола, смешанного с концентратом головных и промежуточных примесей (КГПП) в соотношении 250:3. Для очистки 25 мл смеси использовали навеску того или иного сорбента массой 2 г. Время обработки составляло 20 минут. Исследования проводили с применением 15 различных марок сорбентов (таб. 3). Результаты очистки оценивали с помощью газохроматографической методики.

В таб. 4 приведены данные для исходного искусственно загрязненного спирта и данные для спирта, очищенного сорбентами №№1-7, а в таб. 5 представлены результаты сорбционной очистки сорбентами №8-15. Сопоставляя данные таб. 4 и 5, можно сделать вывод, что наилучшими качественными показателями обладает образец, очищенный катионитом КУ-2, который достаточно давно и успешно применяется для сорбционной очистки водно-спиртовых растворов в ликероводочной промышленности. Хороший результат по снижению суммы альдегидов наблюдается также для сорбентов нового поколения – катионитов Tulsion Т-43 H, Tulsion CXO-12, анионитов Tulsion A 23- Cl^-, Tulsion A-8 XMP и Tulsion A-20 Cl^- (концентрация снижается более чем в 5 раз). Однако в образцах, подвергнутых очистке катионитами Tulsion обнаружена примесь бензальдегида, который по требованиям ГОСТ Р 51652 –2000 должен отсутствовать в спирте. После очистки сорбентом Tulsion T-57 в спирте

обнаружен диэтилфталат, так же недопустимый по нормативной документации.

Таблица 4. Содержание микропримесей (мг/дм3) в искусственно загрязненном этаноле после сорбционной очистки сорбентами №№1-7

 

Таблица 5. Содержание микропримесей (мг/дм3) в искусственно загрязненном этаноле после сорбционной очистки сорбентами №№6-15

 

Хорошую эффективность очистки от эфиров показали слабоосновные аниониты Tulsion A-2 XMP, Tulsion A-8 XMP, Tulsion A-10 XMP , Tulsion A-20 Cl^- , а также сорбент из фильтра «Аквофор» (снижение концентрации примерно в 3 раза). К сожалению, информация о сорбентах, применяемых в этих фильтрах для очистки воды, является «ноу-хау» фирмы-производителя. Снижение концентрации в 1.5-2 раза такого важного экотоксиканта как метанол наблюдали после сорбционной очистки для всех испытанных образцов сорбентов.

Полученные  результаты представляют интерес для дальнейшего совершенствования методов очистки спирта (и полупродуктов спиртового производства), включающего в себя разработку новых сорбентов, конструкций фильтров, реакторов и технологических приемов[6].

 

5.2. Применение ионообменной хроматографии для разделения изоформ малатдегидрогеназы из Sphaerotilus natans штамм Д-507, культивируемых в условиях миксотрофного роста.

Введение.

Sphaerotilus natans штамм Д-507 представляет собой новые матообразующие бесцветные серобактерии, выделенные из термальных источников Краснодарского края. В отличие от других штаммов данного вида, штамм Д-507 способен к хемоорганогетеротрофному и хемолитогетеротрофному росту в присутствии восстановленных соединений серы.

Некоторые виды в зависимости от условий культивирования могут  изменять тип метаболизма от органотрофного до литотрофного. Регуляция метаболизма  осуществляется на уровне отдельных  ферментов, в частности перестройкой субъединичной структуры молекулы. Ранее было показано у серобактерий Beggiatoa leptomitiformis наличие двух изоформ малатдегидрогеназы (МДГ, КФ 1.1.1.37). При адаптации бактерий к литотрофным условиям происходит изменение четвертичной структуры молекулы малатдегидрогеназы. В результате происходит перераспределение роли ЦТК и глиоксилатного цикла.

Бактерии S.natans штамм Д-507 также способны расти миксотрофно. Установлено, что малатдегидрогеназа участвует в функционировании обоих метаболических путей. Поэтому целью нашей работы было разделение изоформ малатдегидрогеназы из бактерий Sphaerotilus natans штамм Д-507 с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭ- целлюлозе, получение их в гомогенном состоянии и изучение физико-химических свойств фермента.

 

Эксперимент.

Объектом исследования служили  матообразующие бесцветные серобактерии рода Sphaerotilus natans. штамм Д-507 культивируемые в условиях миксотрофного роста. Бактерии выделены из термальных источников Краснодарского края.

Для культивирования микроорганизмов  использовали питательную среду  следующего состава (мг/л): NH₄Cl - 1.7; Na₂HPO₄×7H₂O - 34.4; MgSO₄×7H₂O - 22.5; CaCl₂ - 27.5; FeCl₃×6H₂O - 0.25; KH₂PO₄ - 8.5; K₂HPO₄ - 21.5; пептон - 200; лактат - 200; дистиллированная вода; рН среды 7.5. Перед посевом в среды вносили раствор микроэлементов и витаминов - 1.0 х 10^-3 (г/л). Для создания миксотрофных условий в среды вносили тиосульфат 1 г/л.

Суспензию клеток получали путем центрифугирования  культуры при 8000 g и 4⁰С в течение 20 мин. Клетки отмывали 50 мМ mpuc-HCl-буфером (рН 7.5). Клеточный экстракт получали разрушением бактериальных клеток с помощью ультразвукового дезинтегратора УЗДН-2Т при мощности 500 Вт и частоте 22 кГц в течение 2 мин на ледяной бане. Супернатант получали после центрифугирования гомогената при 8000 g и 4⁰С в течение 5 мин.

Активность МДГ определяли спектрофотометрически  при 340 нм. За единицу активности (Е) принимали количество фермента, катализирующего  превращение 1 мкмоль субстрата за 1 мин при 25⁰С. Определение общего количества белка проводили по методу Лоури.

Очистку фермента осуществляли по модифицированной схеме, включающей - получение экстракта  фермента, гель-фильтрацию на колонке  с сефадексом G-25, ионообменную хроматографию на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой.

Молекулярную массу нативного  белка определяли с помощью гель-хроматографии  через сефадекс G-200.

Электрофорез проводили по модифицированной методике Дэвиса в 9% полиакриламидном геле. Для специфического проявления МДГ применяли тетразоливый метод. Для детекции белка использовали методику с нитратом серебра.

 

Результаты и их обсуждение.

Для получения гомогенных препаратов МДГ и разделения изоформ фермента была проведена многостадийная очистка. В результате получены ферментные препараты  малатдегидрогеназы с удельной активностью 2,78 Е/мг белка и степенью очистки 45 раза и 3,37 Е/мг белка со степенью очистки в 54 раза (табл.6).

После ионообменной хроматографии  на ДЭАЭ-целлюлозе малатдегидрогеназа из микроорганизмов была получена в  электрофоретически гомогенном состоянии. Элюцию осуществляли ступенчатым градиентом KCl. Максимум активности МДГ обнаруживался во фракцияз 100-105мМ и 110-115мМ KCl. Электрофоретический анализ очищенного препарата показал, что в геле при универсальном окрашивании на белки проявилось по одной полосе с Rf 0,45 и 0,5 (рис.1). Это свидетельствует о гомогенности МДГ из данных бактерий.

Методом гель-хроматографии на сефадексе  G-200 была определена молекулярная масса МДГ, элюция фермента осуществлялась в виде двух пиков, которым соответствовала молекулярная масса 71 и 141 кДа. Электрофоретическое исследование в присутствии додецилсульфата натрия позволило определить величину молекулярной массы одной субъединицы, которая составила 35 кДа (рис.11, 12).