Изменение содержания флаволигналов в каллусной культуре расоропши пятнистой под действием повышенных и пониженных температур

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

 

Кафедра физиологии и биохимии растений

 

 

 

 

 

ИЗМЕНЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ФЛАВОЛИГНАНОВ В КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЕ РАСТОРОПШИ ПЯТНИСТОЙ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ПОВЫШЕННЫХ И ПОНИЖЕННЫХ ТЕМПЕРАТУР

 

Дипломная работа

cтудентки 6 курса

Графовой О.В.

«Допустить  к защите»

  Зав. каф.  физиологии и                                       Научный руководитель

  биохимии  растений                                             к.б.н., доцент

  проф. Юрин В.М.                                                Дитченко Т.И.

  _____________________

  «____» __________2009 г.

 

 

 

Минск 2009

 

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений и обозначений  …………………………………………3                                                                 

Введение……………………………………………………………………….4                                                                                                                      

Глава 1. Обзор  литературы

          1.1. Расторопша пятнистая – источник биологически

активных  веществ…….…………………………………………….6

1.2. Морфологические, биохимические и физиологические особенности каллусных культур………………………………...11

        1.3. Способы регуляции биосинтеза вторичных метаболитов в культурах клеток и тканей растений……………………………...15

1.4. Изменение  ростовой и биосинтетической  активности    культивируемых in vitro растительных клеток и тканей под действием температурного фактора………………………………20

Глава 2. Материалы  и методы.

2.1. Объект исследования………………………………………………23

2.2. Питательные среды и условия культивирования……………….24

2.3. Определение показателей роста каллусных культур…………….26

2.4. Спектрофотометрическое определение суммы флаволигнанов..27

2.5. Статистическая обработка данных………………………………..28 Глава 3. Результаты и их обсуждения. 3.1. Температурная  зависимость прироста биомассы каллусной культуры расторопши пятнистой……………………………….30 3.2. Влияние повышенных  и пониженных температур на  содержание                      флаволигнанов в каллусной культуре расторопши пятнистой…36 Заключение……………………………………………………………………45 Список литературы…………………………………………………………47   СПИСОК  СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ     БАВ - биологически активные вещества БАС – биологические активные соединения ВМ – вторичный  метаболит; ГСО - государственный  стандартный образец 2,4-Д - 2,4-дихлорфеноксиуксусная  кислота  ИУК - индолил-3- уксусная кислота НУК - α-нафтилуксусная кислота среда MS - питательная среда Мурасиге и Скуга I - индекс роста V - удельная скорость роста μ -  время  удвоения биомассы

 

 

                                                                    

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ВВЕДЕНИЕ

 

Расторопша пятнистая (Silybum marianum) является уникальным источником получения различных биологически активных веществ, таких как флаволигнаны (силибин, силимарин, силикристин и их стереоизомеры), флавоноиды (таксифолин, кверцетин, кемпферол), органические кислоты, смолы, жирные кислоты и белки. Именно благодаря наличию флаволигнанов, плоды этого растения нашли широкое применение в фармацевтике в качестве средства лечения различных гепатопатий: острый и хронический вирусный гепатит, цирроз печени, вызванный лекарственными препаратами или токсинами, а также алкогольное поражение печени, болезней селезенки и пищеварительного тракта.

Терапевтическая эффективность препаратов из плодов расторопши пятнистой базируется на нескольких механизмах действия. Силибин стабилизирует мембраны гепатоцитов, повышает синтез белка в печени, обладает антиоксидантной, противовоспалительной и антибактериальной активностью, нейтрализует свободные радикалы в печени, препятствует разрушению клеточных структур. Специфически стимулирует РНК-полимеразу и активирует синтез структурных и функциональных белков и фосфолипидов в поврежденных гепатоцитах. Стабилизируя клеточные мембраны, предотвращает выход внутриклеточных компонентов (трансаминаз) и ускоряет регенерацию клеток печени. Тормозит проникновение в клетку некоторых гепатотоксических веществ, таких как яд бледной поганки.  Предварительные эксперименты на животных показывают, что силимарин может обладать и антираковой активностью, в частности, в отношении рака груди, простаты и кожи (Куркин, 2003). Семена расторопши пятнистой также богаты маслом, содержащим большое количество полиненасыщенных жирных кислот (Щекатихина и др., 2008). Лекарственные препараты на основе масла применяются при лечении язв, ран, пролежней и воспалительных процессов.

В последние десятилетия в качестве альтернативы традиционно используемому лекарственному сырью все чаще рассматриваются культуры и клеток растений, выращиваемые в асептических условиях на искусственных питательных средах (Tripathi, Tipathi, 2003; Mulabagal, Tsay, 2004). Целенаправленное изменение условий культивирования, генетическая трансформация и мутагенез, а также использование других стратегий для повышения продукции вторичных метаболитов позволяют получить клеточные линии, накапливающие целевые продукты в количествах сопоставимых с таковыми для интактных растений.

Одним из наиболее простых способов регуляции содержания биологически активных веществ в культивируемых in vitro растительных клетках является изменение физических условий культивирования (светового, температурного режимов, аэрации и др.). При этом действие температурного фактора на рост клеточных культур и их биосинтетический потенциал остается наименее изученным. Однако тот факт, что температура оказывает действие на вторичный метаболизм интактных растений, говорит о необходимости исследований в этом направлении. Тем более, что температурные оптимумы для роста культуры клеток и биосинтезов не всегда совпадают.

В связи с этим целью настоящей работы исследование характера влияния повышенных и пониженных температур на показатели роста и содержание флаволигнанов в каллусной культуре расторопшия пятнистой.

 

 

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

 

1. Расторопша пятнистая – источник биологически активных веществ

 

В научной медицине расторопша пятнистая применяется примерно с середины 19 века, однако по-настоящему популярным это растение становится только в начале 70-х годов 20-го столетия. В это время  зарубежные исследователи, в частности, немецких ученые,  выделили из плодов оригинальные биологически активные соединения (БАС), названные флавонолигнанами или флаванолигнанами, а впоследствии — флаволигнанами. Это обстоятельство послужило мощным импульсом к проведению научных исследований по проблеме создания гепатопротекторных или гепатозащитных препаратов на основе плодов расторопши пятнистой. В результате были созданы "Легалон", "Карсил", "Силибор" и другие препараты, обладающие уникальным гепатопротекторным действием. Следует отметить, что расторопша пятнистая за сравнительно небольшой промежуток времени становится одним из самых популярных лекарственных растений (Быков, Куркин, Запесочная, 2000).

Флаволигнаны (флаванолигнаны, флавонолигнаны) – флавоноиды, содержащие в своем составе дополнительный фенилпропаноидный фрагмент (-С6-С3-) (в основном кониферилового спирта), – составляют сравнительно немногочисленную новую группу природных соединений. Это дает основание относить флаволигнаны не только к флавоноидам, но и фенилпропаноидам. Первый представитель флаволигнанов – силибин (рис. 1.1). Данные масс-спектров показали наличие фрагментов характерных для кониферилового спирта. Все это позволило предложить для силибина две возможные структуры (I) и (II) (изосилибин, выделенный из плодов расторопши пятнистой в ходе дальнейших исследований) и высказать мнение, что он образуется в результате окислительного сочетания таксифолина (дигидрокверцетина) и кониферилового спирта (Куркин, 2003).

 

Рис. 1.1. Структурная  формула дигидрокверцетина (1) и силибина (2)

 

В ходе синтеза  цис- и транс-изомеров 1,4-бензодиоксана и хроман-3,4-диола было подтверждено наличие в силибине 1,4-бензо-диоксанового кольца с трансоидным положением заместителей. Силибин образуется в растении путем свободнорадикального окислительного взаимодействия дигидрокверцетина и кониферилового спирта, которое может приводить к смеси регио- и диастереоизомеров.

 В ходе  дальнейших исследований из плодов расторопши пятнистой сначала были выделены силикристин (V) и силидианин (VI), которые относились наряду с силибином к доминирующим флаволигнанам, а затем еще целый ряд флаволигнанов, имеющих флаваноноловую, флавананоновую и флавоноловую природу. При этом следует подчеркнуть, что флаволигнаны выделены лишь в виде их ацетилированных производных.

Наибольший  интерес с точки зрения биологической  активности представляли силибин, силидианин и силикристин (смесь этих веществ получила название «Силимарин»), для которых была установлена уникальная гепатопротекторная активность (Куркин, 1996).

Использование расторопши пятнистой в качестве источника сырья в химико-фармацевтической промышленности инициировало проведение дополнительных исследований ее химического состава. Так, венгерскими учеными в сравнительном плане изучен химический состав флаволигнанов около 100 популяций расторопши пятнистой, происходящих из различных мест Европы. Ими было установлено, что бело-цветковая расторопша пятнистая содержит силандрин (IV) и силимонин (VII) и в целом резко отличается по составу от лиловоцветковой популяции, которая используется в качестве источника сырья при производстве гепатопротекторных препаратов. Было также установлено, что растения лиловоцветковой разновидности обязательно содержат силибин (I) и силидианин (VI), но в различных количествах и соотношениях в зависимости от места произрастания.

Флаволигнаны  плодов расторопши пятнистой имеют  фундаментальные отличия от всех известных на сегодня флавоноидов, причем особенно ценно их свойство — способность нейтрализовывать действие самых сильных для печени ядов, например, ядов гриба бледной поганки. При этом другие флавоноиды и фенилпропаноиды, в том числе образующие структуру силибина (флаванонол таксифолин и конифериловый спирт), не влияют на картину такого отравления. В основе механизма действия флаволигнанов лежит их взаимодействие со свободными радикалами, ведущее к замедлению интенсивности  свободнорадикальных реакций с уменьшением активности и концентрации образующихся токсичных перекисных продуктов, следствием чего является восстановление и стимуляция репаративных процессов печени.

Одним из самых  показательных тестов для определения  гепатозащитной активности препаратов является СС14-гепатит. Это объясняется  тем, что СС14, подвергаясь при  участии микросомальных ферментов  гемолитическому распаду с образованием свободного радикала СС13, выступает как сильный индуктор перекисного окисления ненасыщенных жирных кислот, входящих в состав мембранных фосфолипидов. В результате СС14 подавляет окислительные процессы в митохондриях и цитоплазматическом ретикулуме, лабилизирует мембраны лизосом и освобождает некрозогенные гидролазы. Силибинин (силимарин) препятствует ингибирующему влиянию на активность ферментов печеночной паренхимы: активность щелочной   фосфатазы, глюкозо-6-дегидрогеназы, ферментов митохондрий, цитоплазматического ретикулума и лизосом практически не отличается от нормальной  величины. Силибинин стимулирует экскрецию печенью  бромсульфалеина, тормозит развитие гиперферментемии и гиперлипидемии: в наибольшей степени исследуемый препарат препятствует увеличению активности аспартатаминотрансферазы, щелочной фосфатазы, фосфолипазы А и печеночных изоэнзимов лактатдегидрогеназы; активность аланинаминотрансферазы и урокиназы достоверно ниже, чем при СС14-гепатите, но существенно превышает показатель нормы. Установлено также, что силибинин обладает антиоксидантными свойствами: препятствует образованию диеновых коньюгатов, малонового диальдегида, оснований Шиффа, увеличивает функцию тканевых липидо- и водорастворимых антиоксидантов. Авторы этой работы  делают выводы о том, что механизм гепатозащитного действия силибинина связан с антиоксидантным эффектом и стабилизацией мембран гепатоцитов. Очень важным свойством суммы флаволигнанов силибина (I), силикристина (V) и силидианина является способность оказывать защитное и лечебное действие при галактозаминовой интоксикации, патогенез которой напоминает морфологические изменения, вызванные вирусом гепатита у человека (Куркин, 1996).

Гепатопротекторы  на основе расторопши пятнистой необходимы не только для лечения заболеваний печени, но и для профилактики различных заболеваний, возникающих в результате воздействия на организм неблагоприятных факторов окружающей среды.

Гепатопротекторный  эффект флаволигнанов плодов расторопши пятнистой обусловлен их способностью взаимодействовать со свободными радикалами, реализующейся за счет наличия в их структуре подвижного водорода, используемого для ликвидации свободных радикалов (Лебедев, Батаков, Куркин, 2001).

Флаволигнаны  плодов расторопши замедляют интенсивность радикальных реакций с уменьшением активности и концентрации образующихся токсичных перекисных продуктов и, таким образом, восстанавливают и стимулируют репаративные процессы, стабилизируют биологические мембраны клеток органов гепатобилиарной системы, ингибируют перекисное окисление липидов в биологических мембранах, предотвращая глубокие деструктивные нарушения в печени, тормозят избыточное образование жирных кислот и холестерина, активируют функции естественной антиокислительной защиты. Следовательно, антиоксидантный эффект флаволигнанов плодов расторопши пятнистой приводит к усилению антитоксической функции печени. Кроме того, силибин стимулирует синтез РНК в гепатоцитах, что способствует ускорению регенерации печени.

Особенностью  фармакотерапевтического действия препаратов расторопши пятнистой является то обстоятельство, что они сочетают в себе выраженный гепатозащитный эффект с мягким желчегонным действием. Именно это позволяет использовать разработанные препараты при лечении острых и хронических вирусных гепатитов, токсических гепатитов, цирроза печени, другой патологии печени, в случае которой противопоказано выраженное желчегонное действие.

Таким образом, расторопша пятнистая, сочетающая в себе гепатопротекторные, антитоксические, антиоксидантные и иммуномодулирующие свойства, находится в центре внимания исследователей. Столь широкий спектр воздействия на различные системы организма позволяет определить для расторопши пятнистой особое место в ряду растений как в плане "адресного", специфического воздействия (например, вирусные гепатиты), так и общего, неспецифического активирующего влияния на защитные силы организма.

В качестве альтернативного  источника традиционно используемому сырью данного лекарственного растения могут выступать каллусные, суспензионные культуры, и даже культуры корневых волосков расторопши пятнистой (Fevereiro et al., 1986; Alikaridis et al., 2000; Hasanloo et al., 2008; Rahnama et al., 2008). Клетки и ткани высших растений, выращиваемые на питательных средах in vifro в строго контролируемых условиях, все шире используют в фитобиотехнологии (Мосин, 2002). При этом актуальной задачей является поиск путей, позволяющих приблизить биосинтетический потенциал культивируемых клеток, до уровня соответствующего интактным растениям (Носов, 1999; Пасешниченко, 2001).