Изменение содержания флаволигналов в каллусной культуре расоропши пятнистой под действием повышенных и пониженных температур

Следует отметить, что исследуемая каллусная культура оказалась наиболее чувствительной к изменению температурных условий, что выразилось в повышении продукции флаволигнанов, в ходе лог-фазы ростового цикла. Аналогичная закономерность была выявлена и в отношении температурной зависимости ростовых процессов данной культуры. Это позволяет сделать заключение о взаимосвязи между степенью ингибирования ростовых процессов и стимуляцией накопления флаволигнанов.

Как отмечалось в разделе 1.3., температуры, значительно отличающиеся от оптимальных для данного вида растений, способны вызывать стресс и обычно активизируют вторичный метаболизм (Endreb, 1994). Обнаруженное в наших экспериментах повышение уровней содержания флаволигнанов в каллусах расторопши пятнистой в условиях низкотемпературной инкубации (18 °С), а также повышенной температуры 33 °С можно рассматривать как стереотипную реакцию клеток на стрессовые воздействия. С другой стороны, одной из причин низкого содержания продуктов вторичного метаболизма в растительных клетках, культивируемых in vitro, является отсутствие дифференциации ткани (Валиханова, 1996). В связи с этим практически любые воздействия, способные индуцировать процессы клеточной дифференцировки, могут приводить к повышению продукции вторичных метаболитов.

Для интактных  растений показано, что при длительном действии пониженных температур увеличивается  продолжительность всех фаз митотического цикла и снижается скорость роста клеток в фазе растяжения. Раньше начинается синтез лигнина, поэтому клетки, не достигнув своего окончательного размера, переходят к дифференцировке (Кузнецов, Дмитриева, 2005). Поэтому второй причиной повышения содержания флаволигнанов в клетках каллусной культуры расторопши пятнистой может выступать индукция процессов клеточной дифференциации в результате воздействия пониженных температур (18-21 °С).

Анализ результатов  о ростовой и биосинтетической активности клеток каллусной культуры расторопши пятнистой при варьировании температуры от 18 до 33°С свидетельствует, что оптимальные температуры для роста и накопления флаволигнанов различаются между собой. Если к концу цикла выращивания прирост биомассы слабо зависит от температуры в диапазоне от 21 до 27 °С, то для накопления флаволигнанов оптимальной является температура 18°С.

Выявленные  закономерности могут быть использованы при разработке режимов культивирования клеточной биомассы расторопши пятнистой. При этом на первом этапе культивирование может осуществляться при 21-27 °С, а на втором этапе целесообразно проводить снижение температуры до 18 °С. Однако использование разных температурных режимов в отдельных случаях может быть затруднительным. В связи с этим для определения оптимальных условий для роста и накопления флаволиганов при одностадийном культивировании значительный интерес представляет такой интегральный показатель культуры расторопши пятнистой как общая продуктивность в отношении флаволигнанов, который представляет собой произведение содержания ВМ в культуре на величину прироста биомассы.

Результаты  определения продуктивности каллусной культуры расторопши пятнистой в отношении флаволигнанов при разных температурах представлены на рис. 3.5. Из рисунка видно, что максимальная продуктивность культуры достигается при температуре 18 °С, т.е. при температуре, которая обеспечивает наиболее высокие уровни накопления флаволигананов. Несмотря на некоторое замедление в этом варианте скорости ростовых процессов по сравнению с контролем, общая продуктивность культуры при 18 °С в 2 раза выше, чем при 24,5 °С, и в 3,1 раза – по сравнению с воздействием самой высокой температуры (33 °С).

Таким образом, использование пониженных температур (18-21 °С) является гораздо более приемлемым для культивирования каллусов расторопши пятнистой по сравнению не только с повышенными (30-33 °С) и даже обычными   (25±1 °С) с целью получения таких биологически активных веществ как флаволигнаны.

Рис. 3.5. Зависимость продукции флаволигнанов каллусной культурой расторопши пятнистой от температуры

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования ростовой активности клеток каллусной  культуры расторопши пятнистой и  содержания в них флаволигнанов  при варьировании температуры от 18 до 33°С позволяют сделать следующие выводы:

1. Культивирование каллусов расторопши пятнистой может осуществляться при достаточно широком диапазоне температур (от 18° до 27 °С) без существенного ингибирования роста, поскольку при достижении культурой стационарной фазы ростового цикла, т.е. максимума накопления биомассы, удельная скорость роста и время удвоения биомассы каллусов не претерпевают достоверных различий для указанных вариантов.
2. Максимальное содержание флаволигнанов в каллусах расторопши пятнистой, культивируемых при разных температурах, наблюдается в стационарную фазу ростового цикла.
3. На всех стадиях ростового цикла достоверное повышение содержания флаволигнанов по сравнению с контролем достигается в случае культивирования каллусов при 18 и 33 °С. При этом стимулирующий эффект низкотемпературного воздействия проявляется в гораздо большей степени по сравнению с эффектом повышенной температуры.
4. Наиболее чувствительной к изменению температурного режима культивирования исследованная каллусная культура является в ходе фазы экспоненциального роста, что выражается как в наибольшем замедлении скорости ростовых процессов по сравнению с контролем, так и более выраженном повышении содержания флаволигнанов.
5. При одностадийном культивировании максимальная продуктивность культуры расторопши пятнистой в отношении флаволигнанов может быть достигнута при температуре 18 °С.  Данный  показатель в 2 раза выше, чем при 24,5 °С, и в 3,1 раза – по сравнению с воздействием повышенной температуры – 33 °С.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Беликов В.В. Оценка содержания флавонолпроизводных в плодах Silybum marianum // Растительные ресурсы, 1985. Том 21. №3.
2. Биотехнология растений: культура клеток / Пер. с англ. В.И. Негрука; - М.: Агропромиздат, 1989. – 280 с.
3. Бутенко Р.Г., Гусев М.В., Куркин А.Ф. Клеточная инженерия. –М.: Высш. шк., 1987.
4. Бутенко, Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе: учеб. пособие. М. : ФБК–ПРЕСС, 1999. 160 с.
5. Быков В.А., Куркин В.А., Запесочная Г.Г. и др. Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности; Материалы докладов Международной научной конференции. Томск, 2000.210-212 с.
6. Валиханова Г.Ж. Биотехнология растений.- Алматы, «Конжык», 1996.-272с.
7. Волова Т.Г. Биотехнология. Новосибирск: Изд-во Сибирского отделения Российской академии наук. 1999. 252 с.
8. Дитченко Т.И. Культура клеток, тканей  и органов растений: курс лекций. Мн.: БГУ, 2007. 112 с.
9. Евтушенков А.Н., Фомичев Ю.К. Введение в биотехнологию: курс лекций. Мн.: БГУ, 2002. 105 с.
10. Егорова Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.А. Основы биотехнологии.- М.; Academa, 2003.
11. Загребельный С.Н. Биотехнология. Часть 1. Культивирование продуцентов и очистка продуктов. Новосиб.гос.ун-т, 2000.-108 с.
12. Калинин, Ф.Л. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений / Ф.Л. Калинин, В.В. Сарнацкая, В.Е. Полищук. Киев: Наукова думка, 1980. 356 с.
13. Картель Н. А., Кильчевский А. В. Биотехнология в растениеводстве: учебник. Мн.: Технология, 2005. 310 с.
14. Кузнецов В.В., Дмитриева Г.А. Физиология растений: учеб. для вузов. М.: Высш. шк., 2005. 736 с.
15. Кузьмина Н. А. Основы биотехнологии: учебное пособие. Омск, 2006.
16. Куркин В.А. Расторопша пятнистая - источник лекарственных средств. // Химико - фармацевтический журнал, 2003. Том 37. №4.
17. Куркин В.А. Фенилпропаноиды- перспективные природные биологически активные соединения. СамГМУ, Самара, 1996.
18. Куркин В.А., Запесочная Г.Г., Авдеева Е.В. Количественное определение силибина и суммы флаволигнанов в плодах Silybum marianum // Растительные ресурсы, 1996. Том 32. №3.
19. Кшникаткина А.Н., Гущина В.А., Агапкин Н.Д. Расторопша пятнистая // Пчеловодство, 2003. № 3. С. 24-27.
20. Лебедев А.А., Батаков Е.А., Куркин В.А. Антиоксидантные свойства комплексного гепатопротекторного лекарственного препарата силибохол // Растительные ресурсы, 2001. Том 37. № 2.
21. Мосин О.В. Фитобиотехнология и ее прикладные аспекты. 2002. 18 с.
22. Муромцев Г.С., Бутенко Р.Г, Тихоненко Т.И., Прокофьев М.И. Основы сельскохозяйственной биотехнологии – М.; Агропромиздат, 1990. 384 с.
23. Мэнтелл С.Г., Смит Г. Факторы культивирования, влияющие на наопление вторичных метаболитов в культурах клеток и тканей растений / Биотехнология сельскохозяйственных растений. пер. с англ. В.И. Негрука; М.; Агропромиздат, 1989. С. 75-102.
24. Носов А.М. Культура клеток высших растений – уникальная система, модель, инструмент// Физиология растений. 1999. Т. 46, № 6. С. 837-844.
25. Пасешниченко В.А. Растения – продуценты биологически активных веществ // Соросовский образовательный журнал. 2001. Т. 7. №8. С. 13-19.
26. Першина Л.А. Культивирование изолированных клеток и тканей высших растений: учеб. пособие. Ч. 1. / Л.А. Першина. Новосибирск: НГУ, 2000. 46 с.
27. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. М.: Высш. школа, 1978. 312 с.
28. Сорокина И.К., Старичкова Н.И., Решетникова Т.Б., Гринь Н.А. Основы биотехнологии растений. Куль<span class="dash041e_0441_043d_043e_0432_043d_043e_0439_0020_0442_0435_043a_0441_0442__Char" style=" fo