Изменение содержания флаволигналов в каллусной культуре расоропши пятнистой под действием повышенных и пониженных температур

1.2. Морфологические,  биохимические и физиологические  особенности каллусных культур

Каллусные ткани  являются одним из основных объектов при длительном культивировании in vitro. Для растения каллус представляет собой ткань, возникающую в исключительных обстоятельствах (обычно при травмах) и функционирующую непродолжительное время. Каллус способствует заживлению ран и первоначально состоит из недифференцированных клеток, начало которым на раневой поверхности дают клетки тканей, способные к дедифференциации (камбий, флоэма, молодые клетки ксилемы). Эта ткань защищает место поранения, накапливает питательные вещества для регенерации анатомических структур или утраченного органа (Першина, 2000).

Каллус может  образовываться и на изолированных кусочках ткани (эксплантах) in vitro. Образование и рост каллусной культуры регулируется ауксинами и цитокининами. Эти гормоны индуцируют образование каллуса у тех растений, которые его не образуют в ответ на ранение.

Каллусную ткань  in vitro можно получить практически из любой живой ткани растения. Выбор экспланта в значительной степени определяется целями исследования. В результате процесса дедифференцировки происходит образование in vitro первичного каллуса. Но получить каллус первый раз из нового растительного материала часто бывает трудно, потому что ткани разных видов растений и даже разных частей растения требуют для дедифференциации и каллусогенеза разного количества и соотношения гормонов (Калинин, Сарнацкая, Полищук, 1980; Картель, Кильчевский, 2005).

Во всех случаях  образование каллуса связано  с травматическим воздействием, хотя каллусовые клетки могут возникать  и в результате пролиферации внутренних тканей экспланта без связи с  поверхностью среза. В настоящее  время техника культивирования растительных тканей настолько совершенна, что позволяет получить длительно перевиваемую каллусную культуру из любых живых тканей интактного растения (Евтушенков, Фомичев, 2002).

Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом на агаре, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющих строго определенной анатомической структуры. Однако было бы ошибочно думать, что каллусные ткани однообразны. Исследователи делят их на типы по таким морфологическим признакам, как цвет, консистенция, характер поверхности, а также по интенсивности роста и способности к зеленению (Валиханова, 1996).

Цвет каллусной ткани  может быть беловатым, желтоватым, бурым, коричневым, полностью или частично пигментированным хлорофиллом или  антоцианами. Темно-коричневая окраска часто возникает при старении каллусных клеток и связана с накоплением в них фенолов. Последние окисляются в хиноны. Для избавления от них в питательные среды вносят антиоксиданты (Сорокина и др., 2002).

В зависимости от источника  получения различают гомогенные (содержат один тип клеток) и гетерогенные (содержат несколько типов клеток) каллусы (Першина, 2000).

В зависимости от консистенции каллусные  ткани бывают рыхлыми, среднеплотными и плотными. Рыхлые каллусы состоят  из сильно оводненных клеток и легко распадаются на мелкие агрегаты. Среднеплотные каллусы имеют хорошо выраженные очаги меристематической активности, их клетки могут быть отделены друг от друга сильным взбалтыванием. Для плотных каллусов характерны очень мелкие клетки, а также наличие выраженных зон с камбиальными и трахеиподобными элементами. Отмечено, что компактные каллусы могут дать начало рыхлым тканям, но не наоборот (Бутенко, Гусев, Куркин, 1987).

«Разрыхлить» каллус можно путем  исключения из питательной среды  солей Са²⁺ (в том числе, пантотената кальция). Для этой же цели можно при выращивании в качестве ауксина использовать 2,4-Д. Значительного разрыхления каллуса можно добиться с помощью ферментов – 0,2 мг/л пектиназы и 0,01 мг/л целлюлазы. Таким образом, консистенция каллуса в значительной степени зависит от состава среды (Бутенко, 1999).

В случае получения первичного каллуса при оптимально подобранной  среде часть эксплантов обычно за 3–8 недель образует каллусы в количестве достаточном для пересадки. Для того, чтобы не произошло старения, утраты способности к делению и отмирания каллусных клеток, полученный каллус переносят на свежую питательную среду. Эту операцию называют пассированием. Первичный каллус разделяют на части, которые в дальнейшем культивируются отдельно. Следует обратить внимание на размеры кусочков каллуса, переносимых на свежую питательную среду: если они слишком малы, то дальнейший рост каллуса может быть угнетен. Оптимальный размер пересаживаемого каллуса зависит от вида растения. В некоторых случаях применяется способ субкультивирования без разделения полученного каллуса на отдельные кусочки, при котором после пересадки на свежую среду, каллус продолжает расти всем объемом (Дитченко, 2007).

Каллусные ткани в условиях in vitro можно выращивать неопределенно долго, периодически пересаживая их на свежую питательную среду. Удачно полученные линии каллусных культур требуют регулярной пересадки примерно через каждые 4 недели (Калинин, Сарнацкая, Полещук, 1980).

В зависимости от условий  культивирования и происхождения исходного экспланта в каллусных культурах могут происходить различные преобразования. Одно из них заключается в образовании «привыкшей» ткани. Под действием факторов среды в процессе культивирования могут возникать мутантные клетки – продуценты больших количеств фитогормонов. Если такие клетки получают преимущественное развитие, то в культуре обеспечивается уровень фитогормонов, необходимый для роста ткани на питательной среде без данного регулятора роста. В результате могут формироваться или ауксин-независимые или цитокинин-независимые культуры. Их принято называть «привыкшие» ткани или «химические» опухоли (Кузьмина, 2006).

Генетическая  неоднородность каллусных клеток выражается, прежде всего, в различной плоидности. Популяции клеток in vitro могут иметь в своем составе полиплоидные, моноплоидные, анеуплоидные клетки и клетки с хромосомными абберациями. Можно выделить несколько причин нестабильности генома клеток in vitro:

1. Генетическая гетерогенность определенного вида, сорта, органа, ткани, которые используются для получения первичного каллуса.
2. Нарушение коррелятивных связей при выделении первичного экспланта из растения.
3. Аномалии митотического цикла клеток in vitro.
4. Мутагенное действие экзогенных гормонов и стимуляторов.
5. Длительное субкультивирование каллусных культур, приводящее к накоплению в популяции генетически измененных клеток и клонов.

Обычно наиболее интенсивно процесс перестройки  генома происходит при получении  культуры клеток, а также при существенном изменении условий культивирования.

Генетическая гетерогенность клеток любой популяции не следует  рассматривать как недостаток. Генетическая гетерогенность – это, как правило, необходимое условие ее существования, основа адаптационных возможностей популяции. Она является фактором гомеостаза популяции (Бутенко, 1999; Шевелуха, 2003).

1.3. Способы  регуляции биосинтеза вторичных  метаболитов в культурах клеток  и тканей растений

У культивируемых in vitro клеток могут происходить значительные изменения вторичного метаболизма по сравнению с интактными растениями. Неорганизованно пролиферирующие каллусные клетки в основном характеризуются низким содержанием искомого вещества (Волова, 1999). В то же время у некоторых растений клетки in vitro продуцируют повышенное количество алкалоидов, например, у амми зубной (Ammi visnaga) и некоторых-видов дурмана. Не уступает целому растению по содержанию активных веществ и культура клеток женьшеня (Panax ginseng) (Валиханов, 1996).

У отдельных растений в культуре клеток синтезируются вещества, не обнаруженные in vivo, например, эдулинин и рутакультин у руты душистой (Ruta graveolens) и ароманин у стефании (Stephania cepharantha) (Егорова, Клунова, Живухина, 2003).

У живокости аяксовой (Delphinium ajacis) в составе стеринов у культивируемых клеток было обнаружено больше компонентов, чем у растения-донора. У Andrographis paniculata культивируемые клетки содержали иные сесквитерпены, чем у интактного растения. Спектр стероидных сапонинов и стеринов в клеточной культуре, полученной из корневищ диоскореи дельтовидной (Dioscorea deltoidea), значительно отличался от состава стероидов исходной ткани.

Эти факты говорят о том, что вторичный метаболизм в клетках растений находится в тесной зависимости от процессов развития. Изменение вторичного метаболизма в каллусных культурах вызвано, по-видимому, отсутствием дифференциации ткани. Очень часто дифференцированные культуры тканей синтезируют большие количества вторичных веществ, чем недифференцированные. Однако это не является абсолютным правилом. Появляется все больше данных, что органогенез в культуре не является необходимым условием для биосинтеза вторичных метаболитов in vitro. Например, иногда органогенез сопровождается снижением содержания вторичных веществ. Нарушение автотрофности питания при переходе к гетеротрофному типу обмена также может приводить к неполной реализации генетических возможностей клетки (Валихнова, 1996).

Как уже отмечалось, клетки растений in vitro характеризуются генетической гетерогенностью, что тоже может быть причиной изменения вторичного метаболизма. Вместе с тем гетерогенность клеточной популяции может играть положительную роль, позволяя отбирать линии клеток с сильно измененными свойствами, в частности с повышенным синтезом искомого продукта или синтезирующие совершенно новые вещества (Дитченко, 2007).

Большое влияние на синтез вторичных соединений оказывает минеральный состав среды. При этом наиболее значимыми являются азот, фосфор и калий. Однако их влияние очень специфично как в отношении вида растения, так и в отношении того или иного продукта, о чем свидетельствуют следующие примеры. Так, если у одних культур органические формы азота – пептон, дрожжевой экстракт, гидролизат казеина – тормозят накопление вторичных соединений, то у других – повышают их синтез.

Соотношение аммонийного и нитратного азота в питательной среде также имеет значение. Например, увеличение нитратного азота в среде приводило к повышению синтеза диосгенина культурой клеток диоскореи.

В культуре клеток табака усиливается синтез никотина с уменьшением в среде сахарозы, нитрата и фосфора. Бесфосфатная среда способствовала образованию алкалоидов и других вторичных метаболитов в каллусной культуре гармалы. Недостаток фосфора стимулирует синтез вторичных соединений и у некоторых других культур, но имеются данные и противоположного свойства. Безнитратная среда способствовала увеличению  синтеза капсаицина каллусной культурой перца кустарникового (Валиханова, 1996; Мэнтелл, Смит, 1989; Цыренов, 2003).

Избыток и недостаток углерода вызывает различные реакции  растительных клеток и оказывает значительное влияние на метаболизм растения, рост и развитие. Культуры клеток могут расти на  различных углеводах, но, как правило, лучший рост отмечается на двух источниках углерода: сахарозе и глюкозе. Повышение уровня сахарозы обычно приводит к увеличению выхода вторичных метаболитов. Например, максимальное образование розмариновой кислоты в суспензионной культуре Salvia officinalis составляет 3,5 г/л на среде с 5 % сахарозы, тогда как при 3 % содержании сахарозы в питательной среде этот показатель равен 0,7 г/л. Стимулирующий эффект повышенных концентраций сахарозы на образование вторичных метаболитов может быть связан с увеличением продолжительности стационарной фазы ростового цикла; ингибированием синтеза эндогенных ауксинов; увеличением активности ферментов пентозофосфатного пути (Endreb, 1994).

Однако следует  учитывать, что высокие концентрации сахарозы повышают осмотический потенциал  среды, влияние которого на метаболизм культивируемых клеток не изучено. С  другой стороны, увеличение содержания сахара в среде удоражает производства, поэтому поиск дешевых углеводных добавок остается актуальным (Муромцев и др., 1990).

Среди трофических факторов положительное значение для биосинтеза вторичных веществ имеют некоторые предшественники самих искомых соединений. Можно предполагать, что при продолжительном культивировании тканей в ограниченном объеме питательной среды, когда снижается способность клеток синтезировать органические вещества, добавление в среду предшественников вторичных соединений должно сказаться на их биосинтезе клетками. В качестве предшественников служат аминокислоты (глутамат, фенилаланин, лейцин, орнитин и др.) и органические кислоты (ацетат, сукцинат, шикимовая и др.). Однако не всегда каллусные ткани используют их. Возможно, имеет значение время внесения предшественника в  питательную среду.

Отсутствие желаемого эффекта от внесения в питательную среду предшественников можно объяснить разными причинами: либо они не поглощаются клетками (возможно, клетки синтезируют их сами), либо они распадаются в процессе приготовления и стерилизации среды или переходят в другие физиологически неактивные формы. Не исключено, что предшественники могут оказывать побочные эффекты на рост культуры, в частности ингибировать его. Для выяснения роли предшественников требуются более тщательные исследования с применением радиоактивной метки. Главным препятствием в этих работах является недостаточное знание путей биосинтеза многих продуктов вторичного метаболизма (Биотехнология растений: культура клеток, 1989).

Органические добавки неопределенного состава, такие, как гидролизат казеина и кокосовое молоко, могут оказывать буферное действие. Буферная емкость сред очень низкая, поэтому величина исходного рН (5–6) при культивировании быстро сдвигается на несколько единиц, а это, в свою очередь, сказывается на биосинтетических свойствах и способности к накоплению продукта культивируемых клеток (Цыренов, 2003).

Таким образом, оптимизация питательной среды является ключевым моментом в повышении выхода продукта. Результатом подобных исследований являются так называемые продукционные среды, на которых культивируемые клетки при незначительном или полном отсутствии деления клеток синтезируют значительные количества вторичных метаболитов (Дитченко, 2007).

Физическими факторами, влияющими на накопление вторичных метаболитов клетками, являются свет, температура, аэрация и режим перемешивания в случае суспензии, газовый состав в колбах. Стимулирующее действие света на образование вторичных соединений в культуре клеток показано на примере каротиноидов, эфирных масел, коричных масел, флавоноидов, пластохинонов, антоцианов, катехинов, алкалоидов, витаминов. Свет активировал ферменты фенольного метаболизма, не влияя при этом на ферменты углеводного и липидного обмена. Имеет значение качество света. Так, например, очень эффективным для накопления вторичных веществ культурой клеток петрушки было непрерывное их освещение люминесцентным светом типа «холодный белый». Синтез флавоновых гликозидов клетками петрушки был особенно чувствителен к ультрафиолетовому свету с длинами волн ниже 320 нм и последующему облучению светом в области «красный — длинноволновый красный». По-видимому, в этой культуре более активна низкоэнергетическая фитохромная система. Синий свет увеличивал образование антоцианов в культуре клеток гаплопаппуса. В некоторых случаях свет оказывал ингибирующее действие, подавляя синтез алкалоидов у дурмана и скополии, снижая содержание никотина в каллусах табака, алкалоидов — в культурах клеток хинного дерева, шиконина — в культуре клеток воробейника. Имеются сведения о влиянии освещения на соотношение разных классов вторичных соединений, а также данные об отсутствии светового и темнового воздействия на накопление вторичных метаболитов (Валиханова, 1996).