Изменение содержания флаволигналов в каллусной культуре расоропши пятнистой под действием повышенных и пониженных температур

ГЛАВА 3.

РЕЗУЛЬТАТЫ  И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

 

3.1. Температурная  зависимость прироста биомассы  каллусной культуры расторопши  пятнистой

 

Наиболее важной характеристикой популяции является ее рост. Обычно рост популяции клеток in vitro оценивают по увеличению сырой либо сухой биомассы, а также числа клеток. В целом клетки in vitro проходят фазы ростового цикла, характерные для роста клеток высших растений in vivo.

На рисунке 3.1 приведены данные, отражающие динамику прироста биомассы каллусов расторопши пятнистой, культивируемой при разных температурах. Из рисунка видно, что в ходе ростового цикла наблюдалось последовательное увеличение индекса роста – показателя, характеризующего прирост сырой биомассы каллусов на 1 г исходного веса. Согласно полученным данным при всех вариантах температуры наблюдалось последовательное увеличение индекса роста в ходе цикла выращивания.

В большинстве  случаев при переходе от лог-фазы к стационарной фазе ростового цикла  увеличение индекса роста составляло 1,5-2 раза. Исключение составляет самая  высокая из протестированных температур – 33°С. Для данного варианта к концу цикла выращивания индекс роста каллусов повышался всего лишь на 20 % по сравнению с серединой фазы экспоненциального роста. Таким образом, для исследуемой каллусной культуры столь высокая температура вызывает заметное замедление ростовых процессов.

 

 

 

 

Рис. 3.1. Динамика прироста биомассы каллусов расторопши пятнистой, культивируемых при различных температурах

 

Далее было проанализировано влияние температуры на показатели прироста биомассы каллусов расторопши пятнистой на отдельных стадиях ростового цикла (рис. 3.2.). Как видно из рисунка, характер влияния температуры на индекс роста культуры был различным и зависел от стадии ростового цикла. Согласно полученным данным на начальных этапах ростового цикла (лаг-фаза) прирост биомассы был практически одинаковым при культивировании каллусов расторопши пятнистой в диапазоне 21 - 27 °С. Средние значения индекса роста каллусов при указанных температурах были значительно выше по сравнению с другими вариантами и достоверно не различались между собой. Снижение температуры культивирования до 18°С в свою очередь приводило к резкому снижению прироста биомассы каллусов. Ингибирующий эффект повышенных температур (30° и 33°С) был меньшим по своей величине. Таким образом, можно сделать вывод, что оптимальной температурой для лаг-фазы является диапазон от 21° до 27°С.

На следующей  стадии ростового цикла – лог-фазе – достоверно более высокие значения индекса роста были обнаружены для каллусов, культивируемых при 24,5 °С, т.е. в контроле. Как повышение, так и снижение температуры культивирования каллусов сопровождалось угнетением их ростовой активности. Наиболее близкие к контрольному варианту средние значения индекса роста были получены в результате культивирования каллусов при 27 °С. Дальнейшее повышение температуры до 30 °С приводило к тому, что к середине лог-фазы прирост биомассы каллусов уменьшался в 1,67 раза, а при температуре 33 °С – в 1,93 раза. В результате инкубация культуры в условиях пониженных температур  наблюдалось замедление ростовых процессов в 1,31 раза (при 21 °С) и 2,11 раза (18°С) по сравнению с контролем. Таким образом, в ходе фазы экспоненциального роста отмечалось резкое замедление скорости ростовых процессов каллусов, культивируемых как при пониженных температурах – 18-21°С, так и в условиях ее повышения до 30-33°С.

 

Рис. 3.2. Влияние  различных температур на прирост  биомассы каллусов расторопши пятнистой на отдельных стадиях ростового цикла. * - различия достоверны по сравнению с контролем при р=0,05.

В стационарную фазу ростового цикла ингибирующий эффект повышенных и пониженных температур, как правило, проявлялся в меньшей степени по сравнению с предыдущей стадией, характеризующейся наиболее высокой скоростью ростовых процессов. Следует отметить, что в данном случае прослеживалась тенденция, обнаруженная в ходе лаг-фазы цикла выращивания. А именно, максимальный прирост биомассы каллусов расторопши пятнистой был обнаружен при 21-27 °С. Достоверные различия в величинах индекса роста для данных вариантов отсутствовали. При снижении температуры до 18 °С падение индекса роста каллусов составляло всего лишь 1,24 раза. Аналогичным образом, ингибирование ростовых процессов при 30 °С, которое достигало в среднем 1,31 раза по сравнению с контролем, было менее глубоким, чем в ходе лог-фазы. Самые низкие показатели ростовой активности были обнаружены в случае выращивания каллусов при 33 °С. Индекс роста в данном случае был в 2,23 раза ниже относительно контроля, т.е. ингибирующий эффект проявлялся в большей степени по сравнению с лог-фазой.

Сравнительный анализ представленных данных об изменении интенсивности ростовых процессов каллусов расторопши пятнистой на отдельных стадиях ростового цикла позволяет заключить, что исследованная культура является наиболее чувствительной к изменению температурного режима культивирования в ходе фазы экспоненциального роста. Как известно, в течение данной фазы происходит экспоненциальное (логарифмическое) увеличение количества клеток за счет их интенсивного деления. В клетках исчезает вакуоль и увеличивается объем цитоплазмы, гиалоплазма становится плотной, увеличивается число митохондрий и полирибосом, наблюдается максимум синтеза РНК и белка. Отмечается активное дыхание, происходит синтез индуцибельных ферментов и пластидный синтез липидов, углеводов, пуринов, терпенов (Першина, 2000). Вероятно, вследствие высокой метаболической активности клеток культура становится наиболее отзывчивой к изменению температурного фактора, который способен оказывать влияние на активность ферментов, часть из которых является необходимой для метаболизации источников питания и т.п.

В таблице 3.1. представлены данные по удельной скорости роста и времени удвоения каллусов расторопши пятнистой, культивируемых при разных температурах. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии достоверных различий в величинах анализируемых показателей при варьировании температуры в диапазоне от 18° до 27 °С. Заметное ингибирование ростовых процессов происходит в случае использования максимальной из протестированных температур – 33 °С.

 

Таблица 3.1.

Показатели роста каллусной культуры расторопши  пятнистой

 

Температура, °С	Удельная скорость роста, сут-1	Время удвоения биомассы, сут
18	0,071±0,008	9,8±1,1
21	0,084±0,006	8,3±0,5
24,5	0,083±0,003	8,7±0,3
27	0,078±0,009	9,1±1,0
30	0,065±0,010	11,2±1,9
33	0,038±0,003	18,2±1,3

 

Таким образом, культивирование  каллусов расторопши пятнистой может  осуществляться в достаточно широком  диапазоне температур без существенного  ингибирования роста, поскольку  конечные показатели ростовой активности исследуемой каллусной культуры (стационарная фаза) не претерпевают достоверных различий при температурах от 18° до 27 °С.

Как отмечалось в разделе 2.1., в естественных условиях расторопша пятнистая имеет достаточно широкий  ареал произрастания и встречается на юге Европейской части РФ, на Кавказе, в Западной Сибири и Средней Азии. Это позволяет сделать заключение о неприхотливости данного растения, в том числе и по отношению к температурным условиям выращивания. Рассмотренные выше результаты, полученные для каллусной культуры расторопши пятнистой, вполне согласуются с данным предположением.

 

3.2. Влияние  повышенных и пониженных температур  на содержание флаволигнанов  в каллусной культуре расторопши  пятнистой

 

Установленные закономерности прироста биомассы каллусов расторопши пятнистой в ходе ростового цикла были использованы на следующем этапе изучения динами накопления таких вторичных метаболитов как флаволигнаны. Из литературных данных известно, что характер взаимосвязи накопления вторичных соединений с ростом культуры клеток может значительно различаться (Валиханова, 1996). Выделяют следующие основные варианты:

1) у отдельных  культур максимальное накопление  вторичных метаболитов наблюдается  при завершении лаг-фазы ростового  цикла (например, антоцианы, фенольные соединения, сесквитерпены, антрахиноны);

2) в некоторых  случаях синтез продукта происходит  одновременно с активным ростом  клеток, т.е. в ходе логарифмической  фазы (серпентин, никотин, бетацианин, берберин, диосгенин, сангвинарин);

3) у многих  культур вторичные метаболиты накапливается в значительных количествах лишь при замедлении или остановке роста (хлорогеновая кислота, шиконин, виснагин). При этом предполагается, что механизмы и условия, блокирующие деление клеток и активный рост, является одновременно механизмами активации, обеспечивающими синтез ферментов вторичного метаболизма (Endreb, 1994).

Таким образом, в каждом конкретном случае необходимо проследить динамику накопления вторичных  метаболитов в ходе цикла выращивания  культур для того, чтобы разработать  эффективные технологии их получения.

Определение содержания флаволигнанов в каллусах расторопши пятностой производилось с помощью  спектрофотометрического метода.

При изучении содержания флаволигнанов в каллусах расторопши пятнистой, культивируемых при разных температурах, были получены следующие результаты: при всех вариантах температур максимальное содержание флаволигнанов наблюдалось в стационарную фазу ростового цикла (рис. 3.3). Однако повышение содержания флаволигнанов в каллусах, культивируемых при разных температурах, в течение ростового цикла было неравномерным. Так, в контроле, а  также при использовании температуры 27 °С были обнаружены практически равные уровня накопления флаволигнанов в ходе лаг- и лог-фазы, и только при переходе к стационарной фазе отмечалось существенное возрастание содержания анализируемых вторичных метаболитов. При культивировании каллусов расторопши пятнистой в условиях пониженных температур (18-21 °С) наиболее низкое содержание флаволигнанов было выявлено только в ходе лаг-фазы.  Заметное возрастание их содержания отмечалось уже в ходе экспоненциальной фазы, и далее к концу ростового цикла оно повышалось не столь значительно. В результате этого средние уровни накопления флаволигнанов в лог-фазе и стационарной фазе практически не различались между собой (см. рис. 3.3). Сходные закономерности, хотя и в меньшей степени, проявлялись и для вариантов с использованием повышенных температур (30-33 °С).

Далее был проведен сравнительный анализ содержания флаволигнанов  в каллусах расторопши пятнистой на отдельных стадиях ростового цикла при варьировании температуры от 18° до 33° (рис. 3.4).

 

3.3. Динамика изменения содержания флаволигнанов в каллусах расторопши пятнистой, культивируемых при различных температурах

Рис. 3.4. Влияние повышенных и пониженных температур на содержание флаволигнанов в каллусах расторопши пятнистой на отдельных стадиях ростового цикла

Согласно полученным данным, в лаг-фазу ростового цикла  отмечалась тенденция к возрастанию  содержания флаволигнанов в каллусах, культивируемых при крайних из использованных температур – 18 и 33°С. При варьировании температурного фактора в диапазоне от 21 до 30 °С не обнаружено достоверных различий в уровнях накопления флаволигнанов в исследуемой каллусной культуре. Таким образом, на начальных этапах культивирования только очень сильные изменения температуры культивирования (на 6-9 °С) приводили к повышению уровней накопления вторичных метаболитов (флаволигнанов) в культуре клеток расторопши пятнистой.

На следующей стадии – лог-фазе – наибольшее содержание флаволигнанов также наблюдалось при 18 и 33°С. Причем стимулирующий эффект указанных температур на накопление флаволигнанов  проявлялся в гораздо большей степени, чем на предыдущей стадии цикла выращивания. Так, снижение температуры до 18 °С приводило более чем к 4-х кратному возрастанию содержания анализируемых вторичных метаболитов в каллусах по сравнению с контролем. Стимулирующие эффекты температуры 21 °С, также как и самой высокой температуры – 33 °С были практически равны между собой и составляли в среднем 2,3-2,5 раза по сравнению с контролем. Наименьшее содержание флаволигнанов отмечалось при 24,5 и 27 °С. На стационарной фазе оптимальной температурой для накопления флаволигнанов была 18 °С. Увеличение биосинтетического потенциала культуры достигало при этом 2,5 раза по сравнению с контролем. Т.е. стимулирующий эффект данной температуры оказался несколько ниже, чем в ходе лог-фазы. При 33 °С, хотя и отмечалось увеличение содержания флаволигнанов как на предыдущих стадиях ростового цикла, однако уровни их накопления были гораздо ниже по сравнению с таковыми при 18°С. Также следует отметить, что как и для наиболее оптимальной температуры стимулирующий эффект 33 °С на стационарной фазе оказался ниже, чем в ходе лог-фазы.

Минимальные уровни содержания анализируемых вторичных метаболитов были обнаружены в контроле, а также при 27-30 °С. Для трех указанных вариантов не было обнаружено достоверных различий в величинах содержания анализируемых продуктов вторичного метаболизма. Уровни накопления флаволигнанов в каллусах, культивируемых при 21 °С, также как и в ходе лог-фазы практически не отличались от таковых при 33 °С. Таким образом, для стационарной фазы ростового цикла температурная зависимость накопления флаволигнанов в каллусной культуре расторопши пятнистой характеризовалась наличием главного оптимума при температуре 18 °С.