Изменение содержания флаволигналов в каллусной культуре расоропши пятнистой под действием повышенных и пониженных температур

Температура в  камерах фитотрона в большинстве лабораторий поддерживается на уровне 26±1 °С (Бутенко, 1999). Однако культуры клеток разных видов растений могут значительно отличаться по своим температурным оптимумам для роста и накопления вторичных метаболитов (раздел 1.4).

Аэрация особенно важна для суспензионных культур. Так, у клеток табака увеличение скорости перемешивания увеличивало выход никотина (Endreb, 1994).

В заключение следует отметить, что накопление клетками вторичных продуктов метаболизма является результатом динамического равновесия между биосинтетическим, биотрансформационным и биодеградационным процессами. Влияние внешних и внутренних факторов на каждый из этих процессов сложно и из-за отсутствия фундаментальных знаний не поддается контролю.

 

 

1.4. Изменение ростовой и биосинтетической активности культивируемых in vitro растительных клеток и тканей под действием температурного фактора

 

Данных о влиянии температуры на рост и биосинтезы клеточных культур очень мало. Однако тот факт, что температура оказывает действие на вторичный метаболизм интактных растений, говорит о необходимости исследований в этом направлении (Zobayed et al., 2005). Работы в этом направлении весьма желательны, поскольку температурные оптимумы для роста культуры клеток и биосинтеза вторичных метаболитов не всегда совпадают. Так, например, наилучший рост каллусов гармалы наблюдался при 30 °С, а максимум образования алкалоидов достигался при 25 °С (Валиханова, 1996).

В проростках табака, выращиваемых при 27 °С, накапливается на 100–200 % никотина больше, чем при 21° или 32 °С. Оптимальный рост данной культуры происходит при 32°С, а не при 28° или 24 °С (Matsumoto et al., 1972). В каллусных культурах Peganum оптимальный рост каллуса наблюдали при 30 °С, тогда как максимум образования алкалоидов достигался при 25°С и резко снижался при повышении температуры. Основой таких наблюдений могут стать температурно-зависимые сдвиги в метаболизме культивируемых клеток. Например, в суспензионных культурах клеток Ipomoea максимальная скорость использования как сахарозы, так и аминного азота при температуре 30–32 °С, при температуре 25 °С она снижается примерно на 25 %, хотя скорость роста уменьшается незначительно (Rose, Martin, 1975).

При изучении влияния  температурного фактора на культуру корневых волосков хлопка (Gossypium barbadense и G. hirsutum) было обнаружено, что оптимальной температурой для роста является 28 °С, а оптимальной для синтеза госсипола – 31 °С. Общая продуктивность госсипола (произведение уровня госсипола на массу культуры) была большей при 31 °С, по сравнению с 28°С (Down et al., 2005).

В случае суспензионной  культуры Perilla frutescens повышение температуры в диапазоне от 22 до 28 °С сопровождалось увеличением удельной скорости роста культуры. Однако содержание антоцианов существенно снижалось при относительно высокой температуре (28 °С). Наиболее высокое содержание антоцианов в исследуемой культуре было обнаружено при 25 °С (Zhong J-J., Yoshida T., 1993).

В редких  случаях  максимальный прирост биомассы и  синтез вторичных метаболитов протекают при одинаковой температуре. Так, например, увеличение биомассы Catharantus roseus, а также максимальна продукция некоторых алкалоидов отмечаются при температуре около 27,5 °С (Hoopen et al., 2002).

Температуры, значительно  отличающиеся от оптимальных для данного вида растений, способны вызывать стресс и обычно активизируют вторичный метаболизм. Так, например, содержание жирных кислот в культивируемых клетках растений значительно увеличивается в культурах, выращиваемых при субоптимальных температурах роста (15°С) (Toivonen, 1992).

Температурные сдвиги в  процессе культивирования могут  приводить к изменениям не только количества продуцируемых вторичных  метаболитов, но также и их качественного  состава. Например, для культуры клеток Catharantus roseus было установлено, что изменение температуры в диапазоне от 10° до 45°С приводило к заметному варьированию соотношения серпентин/аймалицин в культуре. При этом низкие температуры (20°С) способствовали накоплению аймалицина, тогда как максимум накопления серпентина был обнаружен при 25°С, и уровень данного алкалоида в культуре резко снижался при понижении температуры (Morris, 1986).

Низкие температуры, как  правило, способствуют ослаблению ингибирующего  влияния 2,4-Д на образование вторичных метаболитов (Еndreb, 1994).

Таким образом, температурный фактор оказывает значительное влияние на рост в условиях in vitro, активность ферментов, часть из которых является необходимой для метаболизации источников питания и др. Даже кратковременные сдвиги температуры в процессе культивирования могут приводить к заметному изменению содержания конечного продукта (Bailey, Nicholson, 2005). В большинстве случаев экспериментаторы выбирают температуру, которая могла быть приемлемой для разных генотипов, Тем не менее, подбор температурного оптимума, как правило, осуществляется эмпирически для каждой культуры в зависимости от целей эксперимента.

 

 

ГЛАВА  2. МАТЕРИАЛЫ  И МЕТОДЫ

 

2.1. Объект  исследования

 

Расторопша  пятнистая - Silybum marianum относится к семейству Сложноцветных:

Царство	Plantae
Подцарство	Tracheobionta
Отдел	Magnoliophyta
Класс	Magnoliopsida
Подкласс	Asteridae
Порядок	Asterales
Семейство	Asteraceae
Род	Silybum Adans.
Вид	Silybum marianum

 

Произрастает  на юге Европейской части РФ, на Кавказе, в Западной Сибири и Средней Азии. Это однолетнее, высотой 1,5 м, травянистое, колючее растение. Стебель прямой или ветвистый, бороздчатый, цилиндрический, голый или слабо опушенный, покрытый мучным налетом. Листья – перистолопастные или перисторассеченные с колючезубчатыми лопастями, зеленые, блестящие, с крупными белыми пятнами; листья розетки - черешковые, стеблевые - сидячие, стеблеобъемлющие.

Соцветие расторопши - многоцветковая круглая корзинка на конце стебля диаметром 3-6 см, окруженная черепитчатой оберткой, которая состоит из колючек и колючих зеленых листочков. Цветоложе плоское, мясистое. Цветки трубчатые, розовые, реже белые, в каждом по 5 тычинок, сросшихся пыльниками в трубку. Нектароносная ткань расположена в глубине цветка вокруг столбика. В корзинке от 80 до 150 цветков, каждый из которых живет и выделяет нектар в течение двух дней.

Период массового  цветения – июль – август (Кшникаткина, Гущина, Агапкин, 2003).

Объектом исследований в настоящей работе служила каллусная  культура Sylibum marianum, полученная из асептических молодых проростков данного растения.

 

2.2. Питательные среды и условия культивирования

 

Для культивирования  каллусов расторопши пятнистой была использована основная питательная  среда по прописи Мурасиге-Скуга (Murashig, Skoog, 1968) с добавлением фитогормонов (таблица 2.1). Эта среда содержит хорошо сбалансированный состав питательных веществ и отличается от других соотношением аммонийного и нитратного азота. Она подвергается разным модификациям в отношении витаминов, гормонов и других регуляторов роста. Среда MS дает хорошие результаты при каллусообразовании у большинства растений, поддерживает неорганизованный каллусный рост и вызывает индукцию морфогенеза у большинства двудольных видов.

Помимо минеральной  основы по прописи Мурасиге и Скуга питательная среда содержала фитогормоны. В качестве ауксина была использована 2,4-Д в концентрации 1,5 мг/л, а в качестве цитокининов – 1,5 мг/л кинетина.

Для приготовления  твердой среды был использован  агар в концентрации 7 г/л. Величина pH питательных сред до автоклавирования составляла 5,7-5,8 (Першина, 2000).

Питательные среды стерилизовали  в автоклаве при температуре 120ºС и давлении 0,5 атм в течение 40 мин. Посуду, предварительно завернутую в фольгу или оберточную бумагу, стерилизовали сухим жаром в сушильном шкафу пре температуре 160 ºС в течение двух часов (Cорокина и др., 2002).

Компоненты	Концентрация, мг/л
КNO3	1900
NH4NO3	1650
MgSO4*7H2O	370
CaCI2	440
KH2PO4	170
MnSO4*7H2O	22,3
ZnSO4*7H2O	8,6
H3BO3	6,2
KJ	0,83
CuSO4*5H2O	0,025
Na2MoO4*2H2O	0,25
CoCI2*6H2O	0,025
FeSO4*7H2O	27,8
NaEDTA	37,3
Сахароза	30 000
Мезоинозит	100
Глицин	2
Тиамин-HCI	0,5
Пиридоксин-HCI	0,5
Никотиновая кислота	0,5

Таблица 2.1.

Состав  основной среды MS, использованной в данной работе

 

 

Каллусы расторопши пятнистой  культивировали в хладотермостате  при температурах 18°С, 21°С, 24,5°С, 27°С, 30°С, 33°С в темноте. В качестве контроля служила культура, выращенная при 24,5°С.

 

2.3. Определение  показателей роста каллусных  культур

 

Для характеристики ростовой активности каллусной культуры расторопши пятнистой в работе производился учет следующих основных параметров: индекса роста, удельной скорости роста, времени удвоения биомассы.

Индекс роста:

 

                                  

                                                                                                                     (2.1),

где W_o – начальная масса каллуса, г;

W_t – масса каллуса в конце цикла выращивания, г.

Удельная скорость роста:

 

                                                                                                                        (2.2)

       где t – продолжительность культивирования, сут.

     Время удвоения биомассы: 

                                                                                                                     (2.3),

где V – удельная скорость роста (Загребельный, 2000).

Определение прироста биомассы каллусных культур, выращиваемых при разных температурах, производили на отдельных стадиях ростового цикла: в ходе лаг-фазы (6-7 сутки), лог-фазы (16-17 сутки) и стационарной фазы (28-30 сут).

 

2.4. Спектрофотометрическое  определение суммы флаволигнанов

 

Для определения суммы  флаволигнанов использовали спиртовой  экстракт Silybum marianum, получаемый следующим образом: 0,5 г тщательной измельченной, предварительно высушенной каллусной ткани помещали в колбу со шлифом емкостью 100 мл, прибавляли 25 мл 96%-ного этилового спирта и кипятили на водяной бане с обратным холодильником в течение 1 ч. Затем колбу охлаждали и доводили до первоначального объема 96 % - ным этиловым спиртом. В результате экстракции получали 25 мл раствора А. Описанный метод экстракции является экспрессным по сравнению с другими видами (например, в аппарате Сокслета) и позволяют сократить время анализа за счет стадии обезжиривания сырья.

Затем по 2 мл полученного  раствора А помещали в пробирки, прибавляли в одну из них 2,5 мл 0,1 М спиртового раствора AlCl₃ (раствор В), в другую- 1 каплю 1%-ной соляной кислоты для создания оптимальной кислотности (раствор С). Объем данных растворов доводили 95%-ным этиловым спиртом до 5 мл. Растворы перемешивали, и через 30 мин измеряли оптическую плотность раствора с хлоридом алюминия (раствор В) на спектрофотометре Cary 50 Bio при 315 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. В качестве контроля применяли раствор С для получения дифференциальных (разностных) спектров и соответствующих дифференциальных величин удельных показателей поглощения.

Содержание  суммы флаволигнанов  в пересчете  на силибин в процентах от сухого вещества вычислялось по формуле:

                     D·V∙V_b

  Х(%)=   ‾‾‾‾‾‾‾‾‾‾‾‾‾‾‾‾‾‾‾‾                                                  (2.4),

                    E_ст∙m∙V_o

 

где D – оптическая плотность исследуемого раствора В;

     E – удельный показатель поглощения комплекса ГСО силибина с хлоридом алюминия при длине волны 315 нм;

M – масса сырья, г;

     V – объем раствора А, мл;

V_о – объем раствора А, взятого для разбавления, мл;

V_b – объем раствора В, мл (Беликов, 1985).

 

2.5. Статистическая  обработка данных

 

Основными статистическими  характеристиками служили: средняя  арифметическая величина (х), среднее  квадратическое отклонение (σ), ошибка средней величины (S_x).

Средняя арифметическая определялась по формуле:

                                                      Sх_i

                                            x =  --------                                       (2.5),

                                                        n

где Sх_i – сумма всех n- повторностей измерения.

Для определения среднего квадратического  отклонения использовалось выражение:

                                                      S( х_i - х)²

                                          σ =      -----------                                     (2.6),

                                                         n – 1

где S(х_i-х)^{2 _} сумма квадратов отклонений от средней арифметической величины.

Ошибка средней величины определялась по формуле:

                                                      σ

                                            S_x = ----                                             (2.7).

                                                     √ n

Статистическую обработку данных производили с помощью программы Microsoft Excel. Для оценки достоверности различий между вариантами пользовались критерием Стьюдента (Рокицкий, 1973).

Все эксперименты выполнены  в трехкратной повторности.