2.Кинетика
ферментативных реакций.Ферментативная кинетика –
это наука,изучающая закономерности влияние
природы реагирующих веществ и сопутствующих
факторов на скорости ферментативных
реакций.Строение веществ,вовлеченных
в химических реакции,определяет скорость
каталитического процесса.Например,гидролиз
пептидной связи под действием протеиназ
происходит с различной скоростью,зависящей
от строения конкретной белковой макромолекулы,вовлеченной
в реакцию.Ферментативные реакции частично
подчиняются закону действующих масс,следовательно,их
скорости зависят от концентрации фермента,субстрата
и температуры.Скорость реакции связана
с реакционной способностью функциональных
группировок активного цента фермента,т.е
зависит от рН реакционной среды.На скорость
реакции влияет также концентрация коферментов,активаторов
и ингибиторов той или иной ферментативной
реакции. Согласно международному соглашению 1 ед. любого фермента
есть такое количество фермента, которое в определенных
условиях катализирует превращение субстрата
со скоростью 1 моль в сек. Описанные общие
принципы кинетики химических реакций
применимы и к ферментативным реакциям. Однако ферментативные
реакции имеют одну отличительную особенность,
которая не свойственна реакциям, протекающим
без фермента. Это насыщение фермента
субстратом. Скорость всех
ферментативных реакций зависит (при прочих
постоянных условиях) от концентрации фермента и его
субстрата. Скорость ферментативной реакции
пропорциональна концентрации фермента.
При увеличении концентрации фермента
скорость реакции увеличивается линейно
(при постоянной концентрации субстрата).
Совершенно другой вид имеет зависимость
скорости ферментативной реакции от концентрации
субстрата при постоянной концентрации
фермента. Итак, отличительной особенностью
ферментативных реакций является насыщение
фермента субстратом. Исследуя это
явление, Михаэлис и Ментен в 1913 году создали
общую теорию действия ферментов и ферментативной
кинетики. На основе этой теории проводится
анализ ферментативной кинетики и ингибирования
ферментативной реакции.
k1 k3
Е + S
ЕS
Е + Р
k2
Анализируя это уравнение по
скорости всех трех реакций Михаэлис и
Ментен вывели уравнение, которое выражает
количественное соотношение между скоростью
ферментативной реакции и концентрацией
субстрата при условии, что известны
максимальная скорость (Vmax) и объединенная
константа, константа Михаэлиса (Km).
k1+ k3
Km = ------------- - константа Михаэлиса
k2
Vmax [S]
v = --------------- - уравнение Михаэлиса-Ментена.
Km + [S]
Vmax
В частном случае, когда v = ----------
Km = [S]
2
т.е. Km = концентрации субстрата,
при которой скорость реакции соответствует
половине максимальной скорости. Km имеет
размерность моль л-1. Величина Km не имеет
строго фиксированного значения. Она может
меняться в зависимости от структуры субстрата,
от рН среды, температуры. У ферментов,
имеющих несколько субстратов, каждый
субстрат характеризуется своим Km. Значение
Vmax у разных ферментов сильно варьирует.
Эта величина зависит от структуры субстрата,
рН и температуры. Уравнение Михаэлиса-Ментена
служит отправной точкой при любом количественном
описании фермента. Его можно алгебраически
преобразовать в другие формы, более удобные
для графического представления экспериментальных
результатов. Одно из самых распространенных
преобразований сводится к тому, что приравнивают
друг другу величины обратные левой и
правой части уравнения Михаэлиса-Ментена.
Vmax [S]
1 Km + [S]
v = ---------------
-- = ---------------
Km + [S]
v Vmax [S]
1 1
1 Km
Решая это уравнение получаем
----- = ------ + ----- -------
v Vmax [S]
Vmax
Это уравнение называется уравнением
Лайнуивера-Берка.Тангенс угла наклона
прямой равен Km/ Vmax, отрезок, отсекаемый
прямой на оси абцисс равен 1/ Km. Отрезок,
отсекаемый прямой на оси ординат равен
1/Vmax. Следовательно, из этого графика легко
можно точно определить значения Vmax и
Km.
3.Активность
ферментов.Способы выражения и
определения активности ферментов.Термин активность достаточно
условен и характеризует способность
ферментов изменять скорости соотвествующих
реакций.Определяется активность по количеству
продуктов реакции или модификации субстрата
под действием фермента. Международная
единица активности фермента обозначается
U.Международная единица активности фермента
- это количество фермента,которое катализирует
превращение одного микромоля(1мкмоль
= 10моль)субстрата за одну минуту при 25
С при оптимальных условиях действия чермента.Удельной активностью-это
яисло единиц фермента,отнесенное к одномумг
белка в ферментном препарате,выражается
в мкмоль/(мин мг) белка.Удельная активность
– это мера чистоты ферментного аппарата:она
возрастает в процессе очистки фермента
и становится максимальной и постоянной,когда
фермент находится в чистом виде.Для чистых
ферментов характерно число оборотов,которое
показывает сколько молекул субстрата
превращается в продукт реакции за единицу
времени в расчете на одну молекулу фермента.
Число молей превращенного субстрата
ЧИСЛО ОБОРОТОВ =
Мин
Международным биохимическим
союзом введен новая единица ферментативной
активности под названием катал(кат).Она
соответствует количеству катализатора,способного
превращать 1 моль субстрата в продукты
за секунду в стандартных условиях.
1кат = 6 10
международных ед(U)
1 международная ед(U) =16,67нкат(нанокаталов)
Для корректного определения
ферментативной активности условия опыта
должны быть максимально стандартизованы
и проводиться в условиях оптимума температуры
и рН.Количество субстрата должно быть
равным или большим,чем необходимо для
поддержания максимальной скорости реакции.Разнообразие
методов оценки ферментативной активности
связано с большим количеством вариантов
ферментативных реакций.Если продукты
реакции или модифицированные субстраты
окрашены,то с большим успехом используют
спектрофотометрические методы,В случае
газообразных продуктов реакции весьма
эффективен полярографический метод и
т.д.Определение каталитической активности
весьма важна для оценки действия ферментов.Кроме
того,знание удельной активности того
или иного фермента лает возможность определить
истинное содержание его в клетке.Содержание
белка в ферментативном препарате определяют
либо по методу Кьельдаля,либо колориметрическим
методом по Лоури,а в прозрачных и неокрашенных
растворах – спектрофотометрическим
при 2880 нм по Ваубургу и Христиану.Различают
экстенсивную и интенсивную регуляцию
активности ферментов в клетках и тканях
организма.Экстенсивная регуляция
обусловлена индукцией или репрессией
генов,кодирующих синтез соотвествующих
ферментов.Уменьшение или увелечение
числа активных молекуд определяет суммарную
активность пула данного фермента в каком
– либо компартметне клетки,в ткани или
целом организме.Интенсивная регуляция
связана с изменением активности зрелых,функционирующих
молекул и определяется разнообразными
молекулярными механизнами.
4.Активаторы и
ингибиторы ферментативных реакций.Типы
ингибирования:конкурентное,неконкурентное
и бесконкурентное ингибирование.Активность ферментов зависит
от присутствии в среде раздичных химичесикх
веществ.Одни из них повышают активность
ферментов,а другие замедляют.Вещества
повышающие активность ферментов,называются
активаторами,а замедляющие – ингибиторами.Чаще
всего в качестве активаторов выступают
ионы металлов.Следует различать металлы
находящиеся в составе металлоферментов,так
называемые кофакторы, и выступающие в
качестве активаторов ферментов.Кофакторы
могут прочно связываться с белковой частью
фермента,что же касается активаторов,то
они легко отделяются от апоферментов.Кофакторы
являются обязательными участниками каталитического
акта;в их отсутствие фермент неактивен.Активаторы
усиливают каталитическое действие,но
их отсутствие не препятствует протеканию
ферментативной реакции.Как правило металл
– кофактор взаимодействует с отрицательно
заряженными группировками субстрата.Металл
с переменной валентностью принимает
участие в обмене электронов между субстраом
и ферментом.Металлы-активаторы принимают
участие в образовании стабильной переходной
конформации фермента,что способствует
более быстрому образованию фермента-субстратного
комплекса.Ингибиторы частично или полностью
тормозят ферментативные реакции.Некоторые
ингибиотры ферментов являются для организма
животных и человека эффективными лекарственными
средствами,некоторые- смертельными ядами.
Одним из фактором, регулирующих ход ферментативной
реакции в интактной клетке является ингибирование
ферментов специфическими клеточными
компонентами. Различают необратимое
ингибирование и обратимое ингибирование. Необратимое ингибирование
- это действие ингибиторов, которое сопровождается
необратимым изменением молекулы фермента. Обратимое ингибирование.
Различают три типа обратимого ингибирования
фермента: 1) конкурентное, 2) неконкурентное
и 3) бесконкурентное. Конкуретным
называется взаимодействующий
с активным центром фермента.Как правило,конкурентные
ингибиторы по структуре похожи на субстрат
и могут вытесняться из фермента – ингибиторного
комплекса избытком субстрата.Взаимодействие
с конкурентным ингибитором не приводит
к денатурации или инактивации фермента,поэтому
при замене ингибитора на субстрат скорость
ферментативной реакции не снижается.Неконкуретные
ингибиторы взаимодействуют с ферментами
не в области активного центра,а на каком-то
от него удалении,причем никаким избытком
субстрата из комплекса не удаляются.При
взаимодействии ингибитора с ферментом
происходит изменение его конформации
с последующей частичной дезинтергацией
активного центра.При взаимодействии
фермента с неконкуретным ингибитором
изменяется V
ферментативной реакции.Бесконкурентное
ингибирование имеет место,когда ингибитор
взаимодействует с ферментом только в
составе фермент-субстратного комплекса,препятствует
его распаду.Примером необратимого действия
ингибиторов на ферменты могут служить
фосфорорганические вещества,применяемые
в качестве инсектицидов.
5.Энергия
активации,механизм действия ферментов.Любая каталитическая реакция
предполагает изменение скоростей как
прямой,так и обратной реакции за счет
снижения ее энергетики.Если химическая
реакция протекает с выделением энергии,то,казалось
бы,она должна начинаться спонтанно.Однако
Этого не происходит ,потому что компоненты
реакции должны быть переведены в активированной(переходное)
состояние.Энергия необходимая для перевода
реагирующих молекул в активированное
состояние,называется энергией активации.Переходное
состояние характеризуется непрерывным
образованием и разрывом химических связей,причем
между переходным и основным состоянием
существует термодинамическое равновесие.Скорость
прямой реакции зависит от температуры
и разности значений свободной энергии
для субстрата а переходном и основном
состояниях.Это разность называется свободной энергией
реакции.Достижение переходного состояния
субстрата возможно двумя путями:придать
реагирующим молекулам избыточную энергию
или снизить энергию активации соответствующей
химической реакции.Общие черты всех каталитических
реакций заключаются в том,что они связаны
со снижением энергии активации.Ферменты
«помогают» субстратам принять переходное
состояние при образовании фермент-субстратного
комплекса.Снижение энергии активации
при ферментативном катализе обусловлено
увеличением числа стадий химического
процесса.Индуцирование ряда промежуточных
реакций приводить к тому,что исходный
активационный барьер дробится на несколько
более низких барьеров,преодолеть которые
реагирующие молекулы могут гораздо быстрее,чем
основной.Механизм действия
ферментов.Среди изученных механизмов
воздействия ферментов можно отметить
следующие:эффект ориентации реагентов(сближение);эффект
деформации субстрата(напряжение);кислотно-основной
катализ;ковалентный катализ.Эффект ориентации
реагентов – очень характерное свойство
ферментов,позволяющее ускорить превращение
в тысячи или десятки раз.Контактные участки
активного центра фермента специфически
связывают субстраты и обеспечивают
их взаимную ориентацию и сближение так,чтобы
это было выгодно для действия каталитических
групп.Такая взаимная ориентация двух
и более молекул,невозможная при беспорядочных
соударениях в водной среде и на поверхности
неорганического катализатора,способствует
увеличению скорости реакции.Упорядоченное
расположение субстратов приводит к снижению
энтропии,а значит,способствует снижению
энергии активации.Эффект деформации
субстрата,хорошо объясняет действие
гидролаз,лиаз и некоторых транфераз.
До присоединения к ферменту субстрат
имеет «расслабленную» конфигурацию.После
связывания с активным центром молекула
субстрата как бы растягивается.Чем больше
длина межатомной связи в субстрате,тем
меньше энергия ее разрыва.Место деформации
легче атакуются, например молекулами
воды.Кислотно-основной
катализ.Особенность активного центра
фермента в отличие от других катализаторов
состоит в том,чтов нем имеются функциональные
группы аминокислотных остатков,которые
проявляют свойства как кислот,так и основания.Поэтому
фермент проявляет в ходе каталитического
акта ксилотно-основные свойства,т.е играет
роль и акцептора, и донора протонов,что
невозможно для обычных каталазаторов.При
закреплении субстрата в активном центре
на его молекулу влият электрофильные
и нуклеофильные группы каталитического
участка,что вызывает перераспределение
электонной плотности на участках субстрата,атакуемого
кислотно-основными группами.Это облегчает
перестройку и разрыв связей в молекуле
субстрата.Ярко выраженной способностью
к кислотно-основному катализу обладают
ферменты,в каталитическом центре которых
имеется гистидин.Ковалентный катализ
наблюдается у ферментов,которые обладают
ковалентные связи между каталитическими
группами активного центра и субстратом.Ковалентные
фермент-субстратные промежуточные продукты
очень неустойчивы и легко распадаются,освобождая
продукты реакции.
6.Свойства
генетического кода.Генетически код – это язык,на
котором гены сообщают клетке какие клетки
в каком количестве ей надо синтезировать.Генетический
код имеет следующие свойства:1)Триплетность
– каждой аминокислоте соответствует
тройка нуклеотидов.Легко подсчитать,что
4
= 64 кодонов.Из них 61 является смысловым
и 3 – бессмысленными( терминирующими).2)Неперекрываемость
– каждый из триплетов генетического
текста независим друг от друга.3)Вырожденность,или
избыточность – отдельные аминокислоты
имеют несколько кодонов.Об этом говорит
простое сравнение:на 20 аминоксилот приходится
61 смысловой кодон,т.е в среднем каждой
аминокислоте соответствует около 3 кодонов.Причина
вырожденности кода состоит в том,что
главную смысловую нагрузку несут два
первых нуклеотида в триплете,а третий
не так важен.Отсюда правило вырожденности
кода:если два кодона имеют два одинаковых
первых нуклеотида,а их третьи нуклеотиды
принадлежат к одному классу,то они кодируют
одну и ту же аминокислоту.4)Специфичность
– каждой аминокислоте соответствует
только определенные кодоны,которые не
могут использоваться для другой аминокислоты.5)Колинеарность
– соотвествие линейной последовательности
кодонов мРНК и аминокислот в белке.6)Универсальность-
все перечисленные выше свойства генетического
кода свойственно всем живых организмам.
7.Факторы,обусловливающие
ускорение реакции ферментов.Влияние температуры.Температура является существенным
фактором,влияющим на скорость ферментативной
реакции.Для большинства,вовлеченных
в односубстратную каталитическую реакцию,зависимость
ее скорости от температуры описывается
колокообразной кривой.На восходящем
участке кривой скорость реакции,согласно
закону действующим масс,пропорционально
температуре,хотя,в отличие от тривиальных
химических реакций,скорость ферментативных
процессов обусловлена такими чакторами,как
влияние температуры на стабильность
фермента к субстрату и др.Нисходящая
ветвь кривой обусловлена в основном денатурацией
фермента и ,как следствие,дезинтеграцией
его активного центра.Исходная термолабильность
фермента является одним из важных показателей
протекания ферментативных реакций при
различных температурах.Известно,что
повышение температуры среды увеличивает
подвижность молекул и это приводит к
повышению скорости химических реакции.Согласно
правилу Вант- Гоффа повышение температуры
на 10С вызывает увеличение скорости реакции
на 2 -3 раза.Поскольку ферменты являются
белками,они при высокой температуре могут
необратимо денатурироваться и терять
свои каталитические свойства.Термическая
инактивация фермента наблюдается при
температуре выше 50 С,но завсисит от длительности
теплового воздействия и природы фермента.При
низких температурах,около 0С и ниже,скорость
ферментативных реакций очень мала.Влияние рН.Ферменты
крайне чувствительны к изменениям концентрации
водородных ионов.Это обусловлена такими
причинами,как степень ионизации функциональных
группировок,особенно в активном центре
фермента,изменениями структуры белковой
макромолекулы,а также влияниемрН на степень
связывания фермента с субстратом.Так
же ака и температура зависимость ,рН –
зависимость скорости ферментативной
реакции имеет колокообразную форму.Функционльные
группы активного центра фермента наиболее
эффективно взаимодействуют с субстратом,имея
оптимальную степень ионизации,обусловленную
соответствующим значением рН.Это сотвествует
максимальной скорости реакции,отклонение
от этих значений приводит к снижению
скоростей реакции,а при крайних значениях
рН – и к денатурации белка – фермента.Вляиние
рН на образование фермента – субстратного
комплекса,кроме ионизации функциональных
группировок фермента,можно оказывать
существенно влияние на определенные
группы субстрата,что также влияет на
скорость реакции.