Лекции по "Биохимия"

26. Коферменты на основе витаминов. Примеры.  К числу коферментных препаратов витаминной природы относятся кокарбоксилаза (коферментная форма тиамина - витамин В1), пиридоксальфосфат. (витамин Вб), кобамамид (витамин В 12). Кокарбоксилаза. Кофермент, образующийся в организме человека из поступающего извне тиамина. Кобамамид. Обладает всеми свойствами витамина В 12 и анаболической активностью. Оксикобаламин. Является метаболитом цианкобаламина (витамин В12). По фармакологическому действию близок витамину В 12, но по сравнению с ним быстрее превращается в организме в активную коферментную форму и дольше сохраняется в крови, так как более прочно связывается с белками плазмы и медленнее выделяется с мочой. Пиридоксальфосфат. Является коферментной формой витамина Вб (пиридоксина). Пиридитол, Энцефабол (Пиритинол). Активирует метаболические процессы в ЦНС, способствует ускорению проникновения глюкозы через гема-тоэнцефалический барьер, снижает избыточное образование молочной кислоты, повышает устойчивость тканей к гипоксии. Пантогам (гомолог пантотеновой кислоты, содержащий гамма-аминомасляную кислоту). Улучшает обменные процессы, повышает устойчивость к гипоксии, уменьшает реакции на болевые раздражения. Карнитин. Витаминоподобное вещество, частично поступающее с пищей, частично синтезируемое в организме человека. Способствует окислению жирных кислот, синтезу аминокислот и нуклеиновых кислот. Флавинат. Кофермент, который образуется в организме из рибофлавина путем фосфорилирования при участии АМФ. Липоевая кислота. Положительно влияет на углеводный обмен. Ускоряет окисление углеводов и жирных кислот, способствует повышению энергетического потенциала. Фосфаден. (Синонимы: АМФ, аденил, аденозинмоно-фосфат).  Бета-каротин. В организме превращается в витамин А, когда мы испытываем его нехватку. Бета-каротин, поступивший с едой, используется организмом как антиоксидант.

27. Коферменты оксидоредуктаз. К оксидоредуктазам относится большая группа ферментов (ок. 20% от общего их числа). Многие оксидоредуктазы (ок. 170 ферментов) в качестве акцепторов используют никотинамидные коферменты -никотинамидадениндинуклеотид (НАД) и никотин-амидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ). Эти дегидрогеназы (напр., алъдегиддегидрогеназа, лактатдегидрогеназа)выполняют важные ф-ции, участвуя в гликолизе, дыхании, брожении, а также на начальном этапе окислит, распада аминокислот при деградации белков. Нек-рые дегидрогена-зы аминокислот (напр., глутаматдегидрогеназа)могут катализировать синтез аминокислот, участвуя в ассимиляции NH3 микроорганизмами и растениями. Считается, что восстановит. эквиваленты от восстановленного НАД (т. е. от НАДН) переносятся в клетке на О2 через дыхат. цепь переноса , где своб. энергия этих эквивалентов расходуется для запасания энергии в виде макроэргич. связи АТФ; восстановит. эквиваленты НАДФН расходуются для биосинтетич. целей.  Ряд дегидрогеназ в качестве акцептора содержит химически прочно связанный с ферментом флавинмононуклеотид или флавинадениндинуклеотид (соотв. ФМН и ФАД;). В таких флавопротеидах ФМН или ФАД восстанавливаются в результате окисления НАДН или НАДФН, а затем передают восстановит. эквиваленты др. компонентам цепи переноса электронов при дыхании, напр. цитохромам или непосредственно на О2. Др. продукт р-ций, катализируемых флавопротеидными оксидоредуктазами,-Н2О2. Ферменты, использующие Н2О2 в качестве акцепторов восстановит. эквивалентов (напр., каталаза), иаз. пероксидазами.

28. Классификация  ферментов. Тип катализируемой химической реакции в сочетании с названием субстрата (субстратов) служит основой для систематического наименования ферментов. Согласно Международной классификации, ферменты делят на шесть главных классов, в каждом из которых несколько подклассов: 1) оксидоредуктазы; 2) трансферазы; 3) гидролазы; 4) лиазы; 5) изомеразы; 6) лигазы(синтетазы). Оксидоредуктазы. К классу оксидоредуктаз относят ферменты, катализирующие с участием двух субстратов окислительно-восстановительные реакции, лежащие в основе биологического окисления. Систематические названия их составляют по форме «донор: акцептор оксидоредуктаза». Например, лактат: НАД+ оксидоредуктаза для лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Различают следующие основные оксидоредуктазы: аэробные дегидро-геназы или оксидазы, катализирующие перенос протонов(электронов) непосредственно на кислород; анаэробные дегидрогеназы, ускоряющие перенос протонов (электронов) на промежуточный субстрат, но не на кислород; цитохромы, катализирующие перенос только электронов. К этому классу относят также гемсодержащие ферменты каталазу и пероксидазу, катализирующие реакции с участием перекиси водорода. Трансферазы. К классу трансфераз относят ферменты, катализирующие реакции межмолекулярного переноса различных атомов, групп атомов и радикалов. Наименование их составляется по форме «донор: транспортируемая группа – трансфераза». Различают трансферазы, катализирующие перенос одноуглеродных остатков, ацильных, гликозильных, альдегидных или кетонных, нуклеотидных

29. Химотрипсин. Механизм действия. Химотрипсин – протеаза, катализирующая гидролиз пептидной связи, рядом с которой находится ароматическая аминокислота (Trp, Phe,Tyr). Реакция, катализируемая химотрипсином, иллюстрирует принцип стабилизации переходного состояния и является классическим примером общего кислотно-основного катализа и ковалентного катализа. Каталитический цикл состоит из двух фаз, в первой из которых разрывается пептидная связь субстрата и образуется эфирная связь между

карбонильным углеромом пептида и OH-группой Ser195 : формируется ацил-фермент (интермедиат). Во  второй фазе происходит гидролиз эфирной связи и регенерация свободного фермента. 

30. Орнитиновый цикл. Цикл мочевины или орнитиновый цикл (цикл Кребса-Хензелейта)— последовательность биохимических реакций млекопитающих и некоторых рыб, в результате которой азотсодержащие продукты распада преобразуются в мочевину, которая в свою очередь выделяется почками. В большинстве случаев таким образом происходит превращение аммиака. Реакции в митохондрии: Непосредственно перед циклом происходит образование карбомоилфосфата из аммиака, воды и углекислого газа при участии фермента карбомоилфосфат-синтетазы(на схеме не показано). Данная реакция происходит с затратой энергии двух молекул АТФ и образованием двух молекул АДФ. При участии орнитин-карбомоил-трансферазы (орнитинтранскарбомоилазы) остаток карбомоилфосфата присоединяется к молекуле орнитина, что приводит к образованию молекулы цитрулина, которая переносится в цитозоль. Реакции в цитоплазме: В цитоплазме цитрулин с аспарагиновой кислотой при участии фермента аргининсукцинат-синтетазы образует совместно аргининосукцинат. В ходе данной реакции расходуется энергия превращения одной молекулы АТФ в АМФ (что эквивалентно превращению двух молекул АТФ в АДФ). Образовавшийся в ходе реакции дифосфатгидролизируется для обеспечения необратимости процесса (на схеме не показано). Под действием фермента аргининосукцинат-лиазы аргининосукцинат распадается на фумарат и аргинин. Аргинин в свою очередь гидролизируется при участии аргиназы (аргининогидролазы) с образованием мочевины и орнитина, который сразу же переносится в митохондрию и цикл повторяется вновь. Суммарное уравнение реакций: 2NH3 + CO2 + 3ATФ + аспарагиновая кислота + 3H2O → мочевина + фумарат + 2AДФ +2Фн+ АМФ + ФФн  Энергетический выход цикла составляет затрату четырёх макроэргических связей на одну молекулу мочевины, поскольку пирофосфат далее превращается до фосфата. Следует заметить, что полученная в процессе реакции аргининосукциназы молекула фумарата снижает энергетическую стоимость цикла. Фумарат, реагируя с молекулой воды в цитозоле, дает малат. Малат же вступает в цикл Кребса и с помощью NAD окисляется. Продуктами этой реакции являются NADH и оксалоацетат. NADH вступает вдыхательную электронтранспортную цепь. Окисление NADH дает примерно 2,5 молекул АТФ, следовательно, стоимость цикла мочевины после этих дополнительных реакций составляет 1,5 молекул АТФ.

3часть) 1.Общие и специфические реакции

Общая реакция - она может быть использована для точного определения очень небольших концентраций аминокислот. 1.Биуретовая реакция,реакция на биурет, которую осуществляют, прибавляя к щелочному раствору последнего разбавленный водный раствор соли Сu2+ (обычно CuSO4). При этом раствор окрашивается в интенсивный фиолетовый цвет .2. Все аминокислоты и пептиды, содержащие свободную α-аминогруппу дают с нингидрином синюю окраску, пролин и оксипролин, содержащие замещенную α-аминогруппу, образуют с нингидрином желтую окраску. Нингидриновая реакция,реакция на α -аминокислоты, которую осуществляют нагреванием последних в щелочном растворе избытка нингидрина . При этом раствор окрашивается в фиолетово-синюю окраску.Существует ряд специфических реакций на функциональные группы боковых цепей аминокислот,которые позволяют определить присутствие их в молекуле белка.1. Реакция Сакагучи - на гуанидиновую группу аргинина. 2. Реакция Паули – применяется для обнаружения гистидина и тирозина. 3. Реагент Эллмана – на SH-группы цистеина. 4. Реакция Эрлиха -основана на том, что производные индола при взаимодействии со многими ароматическими альдегидами образуют интенсивно окрашенные продукты. Реакция может быть использована для количественного определения триптофана в белках.5. Ксантопротеиновая реакция – реакция основана на способности ароматических аминокислот образовывать с крепкой азотной кислотой при подогревании окрашенное в желтый цвет нитросоединение. Реакция может быть использована для определения тирозина, фенилаланина и триптофана в составе белков или биологических жидкостей. 6. Реакция Фоля – реакция на серу содержащие аминокислоты. 7. Реакция Миллона – реакция основана на образовании окрашенного в красный цвет ртутной соли нитросоединения тирозина. Она используется для качественного и количественного определения тирозина в белке и гидролизатах белка.

2.При  помощи каких реакций можно  обнаружить редуцирующие сахара.Количественное определение сахара по методу Бертрана.Ход работы:Отвешивают на весах 5-10г свежего растительного материала или 1 г сухофруктов,растирают в форфоровой ступке и переносят в коническую клбочку с 25 мл воды.Содержимое колбочки кипятят на плитке в течение 3-5 мин.Охлаждают смесь фильтруют и промывными водами ее объем доводят до метки в мерном цилиндре до 50 или 100 мл.В коническую колбочку отбирают 5 мл вытяжки из общего объема,добавляют 5 мл реактива Фелинга и ставят на плитку.Полученную смесь нагревают до кипения и медленно кипятят ровно 3 мин.Выпадает красный осадок закиси меди.Жидкость над осатком должна имеет синий цвет;если она бесцветна нужно взять меньшее количество вытяжки.Осадку дают время остыть и жидкость над осадком сливают осторожно на фильтр.Для растворения осадка окиси меди приливают 5-10 мл раствора сернокислого окисного железа или раствора железоаммиачных квасцов.После растворения осадка колбу и филтр промывают холодной водой.Содержимое колбы титруют раствором перманганата калия до слабо-розового окрашивания

          X =        

А-количество глюкозы во взятой вытяжки,мг

Б-объем всей вытяжки,мл(50)

Б -навеска (1г)

А -объем взятой вытяжки (5мл)

3.Специфичность  ферментов.Проведем эксперимент для определения специфичности фермента амилаза.Ход работы:В 2 пробирки приливают по 0,5 мл слюны,разведенной в 20 раз.С этой целью берут 0,5 мл слюны и добавляют 9,5мл Н О.В одну из пробирок к 0,5 мл I% раствора сахарозы,во вторую  -0,5 мл 1% крахмала.Обе пробирки помещают на 15 мин в термостат или водяную баню при  t = 38 С,после чего с содержимым пробирок проделывают реакцию Троммеров.Это этого к ним приливают 1 мл 10% раствора NаОН,несколько капель серной меди и нагревают.В присутствии углеводов,обладающих восстанавливающими  свойствами,развивается желтая,переходящая в красную окраску.Вывод:после проведенного эксперимента,мы заметим,что в пробирке один реакция не прошла,так как сахароза не вступила в реакцию с амилазой.Во второй пробирке произошла реакция с крахмалом.Так как для фермента амилаза субстратом является крахмал,при это образовался красный осадок.

4.Какую  качественную реакцию на белки  можно использовать для их  количественного определения?

Самым распространенным химическим методом количественного определения белка является колориметрический метод.Он основан на измерении интенсивности цветных реакций,развивающихся при взаимодействии  белков с тем или иным специфическим реагентом.Чтобы рассчитать концентрацию белка,строят калибровочный график.Данный метод количественного определения белка основан на способности пептидных связей белков и полипептидов образовывать с ионами Сu в щелочной среде комплексное соединение фиолетового цвета,интенсивность окраски которого пропорциональна  содержанию белка не отличается высокой чувствительностью.Именно поэтому он применяется в тех случиях,когда содержание белка в исследуемом образце достаточно велико.Ход работы: построение калибровочной кривой.Для построения калибровочной кривой готовится раствор стандартного белка(альбумин или казеин) известной концентрации – 10мг/мл.Из стандартного раствора готовят разведения,по которым затем и будет построена калибровочная кривая.После приготовления разведенной из стандартного  раствора проделывают следующее.1.В штатив размещают 5 пробирок,3 из которых представляет собой приготовленные разведения,содер. По 1 мл разведенного белка2.две другие содержать образец белка,коцентрация которого нужно определить,а шестая пробирка будет являться контролем.3.проводят биуретовую реакцию,разливая реактивы по след схеме:

Через 30 мин измеряю показатель экстинкции каждой пробы на фотоэлектроколориметре,против Конт.раствора(пробирка-контроль) в кювете толщиной 1 см,при длине волны 540 -560нм(зеленый светофильтр).По полученным показателям экстинкции строят калибровочную кривую,отклад.по оси ординат значения экстинкции( ),по оси абцисс – концент.белка(мг/мл).Содержание белка в исследуемом образце находят по построенной калибровочной кривой.

5. Как и для чего строится  калибровочный график?

Калибровочный график - график, построенный по измерениям, выполненным для набора эталонных растворов. По оси ординат откладывается концентрация иона в % в логарифмическом масштабе, по оси абсцисс - величина потенциала. По графику с помощью интерполяции определяется концентрация определяемого иона в исследуемом растворе. Калибровочный график обычно строят в координатах оптическая плотность – объем стандартного раствора, чтобы избежать округления данных и уменьшения точности определения.При построении калибровочного графика (на миллиметровой бумаге) необходимо правильно выбрать масштаб с тем, чтобы точность вычислений соответствовала точности исходных данных и требуемой точности результата измерений. При этом разметка осей производится в масштабных единицах,а не по значениям экспериментальных величин.Для построения калибровочной кривой готовится раствор стандартного белка(альбумин или казеин) известной концентрации – 10мг/мл.Из стандартного раствора готовят разведения,по которым затем и будет построена калибровочная кривая.После приготовления разведенной из стандартного  раствора проделывают следующее.1.В штатив размещают 5 пробирок,3 из которых представляет собой приготовленные разведения,содер. По 1 мл разведенного белка2.две другие содержать образец белка,коцентрация которого нужно определить,а шестая пробирка будет являться контролем.3.проводят биуретовую реакцию,разливая реактивы по след схеме:

Через 30 мин измеряю показатель экстинкции каждой пробы на фотоэлектроколориметре,против Конт.раствора(пробирка-контроль) в кювете толщиной 1 см,при длине волны 540 -560нм(зеленый светофильтр).По полученным показателям экстинкции строят калибровочную кривую,отклад.по оси ординат значения экстинкции( ),по оси абцисс – концент.белка(мг/мл).Содержание белка в исследуемом образце находят по построенной калибровочной кривой.