Лекции по "Биохимия"

8.Строение  рибосом прокариотических и эукариотических  организмов.

Рибосомы – это нуклеопротеиновые органеллы,обеспечивающие синтез белка на мРНК – матрице.Число рибосом в клетке очень велико:от   у прокариот и   у эукариот.Локализуются рибосомы главным образом в цитоплазме,у эукариот,кроме того,в ядрышке,в матриксе митохондрий и строме хлоропластов.Рибосомы состоит из двух субчастиц:большой и малой.По размерам и молекулярной массе все изученные до сир пор рибосомы делятся на 3 группы – 70S рибосомы прокариот,состоящие из малой 30S и большой 50S,80S рибосомы эукариот,состооящие из 40S малой и 60S большой субчастиц,и рибосомы митохондрий и хлоропластов,которые в общем относят к классу 70S,однако они различаются  по коэффициентам седиментации у разных групп эукариот.Малая субчастица 80S рибосом образована одной молекулой рРНК(18S) и 33 молекулами различных белков.Большая субчастица образована тремя молекулами рРНК(5S,5,8S и 28S) и примерно из 50 белками.Все рРНК,за исключением 5S РНК,имеют общего предшественника - 45S РНК,локализованную в ядрышке.Прокариотические рибосомы и рибосомы митохондрий  и пластид содержат меньше компонентов,но структурно и функционально очень сходны с эукариотическими.Вторичная структура рРНК образована за счет коротких двуспиральных участков молекулы – шпилек.Около 2/3 рРНК организована в шпилке,1/3 – представлена однотяжевыми участками,бонатыми пуриновыми нуклеотидами,с которыми преимущественно связываются белки.Белки рибосом,подобно гистонам,обладают основынм характером,выполняют как тсруктурну,так и ферментативную роль.Рибосомные РНК являются не только структурными компонентами рибосом,но и обеспечивают правильное связывание их с определенной нуклеотидной последовательностью мРНК,устанавливая тем самым начало и рамку считывания при образовании полипептидной цепи.Кроме того,рРНК участвуют в обеспечении взаимодействия рибосом с тРНК.В рибосоам имеются две борозды,одна из них удерживает мРНК,другая – растущую полипептидную цепь.Помимо этого,в рибосомах имеются два участка,связывающих тРНК – аминоацильный(А-участок) и пептидильный(П-участок).Образование и функционирование А- и П- участков обеспечивается обеими субчастицами рибосом.

9.Активация  аминокислот.Большая часть пула аминоксилот в цитоплазме клеток находится  не в свободном состоянии,а в виде аминоацил –тРНК.Это предохраняет аминокислоты о метаболических певращений и способствует сохранению набора аминокислот для синтеза белка.Образование комплекса аминокислота-тРНК предшествует активации аминокислоты и нахождение соответствующей тРНК(рекогниция).Это происходит под действием фермента аминоацил – тРНК – синтетазы,или АРС – азы.Эти ферменты имеют два активных центра,одна из которых соответствует определенной тРНК,а другой строго специфичен соответствующей аминокислоте.Таким образом,в клетке должно быть не менее 20 АРС-аз.Образование аминоацил –тРНК происходит в два этапа,первым из которых является взаимодействие аминокислоты(Ак) с макроэргом АТФ:

                           Ак  + АТФ  Ак  ~ АМФ + ФФ

Аминоациладенилат(Ак  ~ АМФ) остается в комплексе с АРС –азой до присоединения ко второму активному центру фермента тРНК.При взаимодействии комплекса (Ак  ~ АМФ) – АРС –азой с тРНК образуется аминоацил – тРНК(Ак –тРНК);при это мвыделяется свободный фермент и АМФ:

(Ак  ~ АМФ)- АРС –аза  + тРНК        Ак  ~ тРНК +АМФ +АРС –аза

10)прем  РНК в эукариотических клетках, процессинг

В то время, как мРНК прокариот (бактерий и архей), за редкими исключениями, сразу готовы к трансляции и не требуют специальной обработки, эукариотические пре-мРНК подвергаются интенсивным модификациям. Так, одновременно с транскрипцией на уже синтезированном участке мРНК происходит «редактирование»(сплайсинг). В процессе сплайсинга из пре-мРНК удаляются не кодирующие белок последовательности — (интроны), на 5' конец молекулы добавляется специальный модифицированный нуклеотид (кэп), на 3' конец добавляются несколько аденинов, так называемый полиадениновый хвост. Кэп узнаётся факторами инициации, белками, отвечающими за присоединение к мРНК рибосомы, полиадениновый хвост связывается с со специальным белком, ПАБ. Обычно эти посттранскрипционные изменения мРНК эукариот обозначают термином «процессинг мРНК». Полиаденилирование необходимо для транспорта большинства мРНК в цитоплазму и защищает молекулы мРНК от быстрой деградации (увеличивает время их полужизни). Лишенные поли-А участка молекулы мРНК (например, вирусные) быстро разрушаются в цитоплазме клеток эукариот рибонуклеазами.

Процессинг РНК (посттранскрипционные модификации РНК) — совокупность процессов в клетках эукариот, которые приводят к превращению первичного транскрипта РНК в зрелую РНК.

Наиболее известен процессинг матричных РНК, которые во время своего синтеза подвергаются модификациям: кэпированию, сплайсингу и полиаденилированию. Также модифицируются (другими механизмами) рибосомные РНК, транспортные РНК и малые ядерные РНК.

Кэпирование.При кэпировании происходит присоединение к 5'-концу транскрипта 7-метилгуанозина посредством трифосфатного моста, соединяющего их в необычной позиции 5'-5', а также метилирование рибоз двух первых нуклеотидов. Процесс кэпирования происходит во время транскрипции молекулы пре-мРНК. Кэпирование защищает 5'-конец первичного транскрипта мРНК от действия рибонуклеаз, специфически разрезающих фосфодиэфирные связи в направлении 5’→3'.

Функции кэпа и связанных с ним белков:экспорт мРНК из ядра;защита 5'-конца транскрипта от экзонуклеаз;участие в инициации трансляции;участие в полиаденилировании.

Полиаденилирование.Фермент поли(А)-полимераза присоединяет 3'-концу транскрипта от 100 до 200 остатков адениловой кислоты. Полиаденилирование осуществляется при наличии сигнальной последовательности 5'- AAUAAA-3' на 3'-конце транскрипта, за которой следует 5'-CA-3'. Вторая последовательность является сайтом разрезания.Сплайсинг.После полиаденилирования мРНК подвергается сплайсингу, в ходе процессе которого удаляются интроны (участки, которые не кодируют белки), а экзоны (участки, кодирующие белки) сшиваются и образуют единую молекулу . Сплайсинг катализируется крупным нуклеопротеидным комплексом — сплайсосомой, состоящей из белков и малых ядерных РНК. Многие пре-мРНК могут быть подвергнуты сплайсингу разными путями, при этом образуются разные зрелые мРНК, кодирующие разные последовательности аминокислот (альтернативный сплайсинг).

11)Биосинтез  белка. Основные этапы.Биосинтез белка — сложный многостадийный процесс синтеза полипептидной цепи из аминокислотных остатков, происходящий на рибосомах клеток живых организмов с участием молекул мРНК и тРНК.Биосинтез белка можно разделить на стадии транскрипции, процессинга и трансляции. Во время транскрипции происходит считывание генетической информации, зашифрованной в молекулах ДНК, и запись этой информации в молекулы иРНК. В ходе ряда последовательных стадий процессинга из мРНК удаляются некоторые фрагменты, ненужные в последующих стадиях, и происходит редактирование нуклеотидных последовательностей. После транспортировки кода из ядра к рибосомам происходит собственно синтез белковых молекул, путём присоединения отдельных аминокислотных остатков к растущей полипептидной цепи.Процессинг РНК.Между транскрипцией и трансляцией молекула мРНК претерпевает ряд последовательных изменений, которые обеспечивают созревание функционирующей матрицы для синтеза полипептидной цепочки. К 5΄-концу присоединяется кэп, а к 3΄-концу поли-А хвост, который увеличивает длительность жизни иРНК. С появлением процессинга в эукариотической клетке стало возможно комбинирование экзонов гена для получения большего разнообразия белков, кодируемым единой последовательностью нуклеотидов ДНК, — альтернативный сплайсинг.Трансляция.Трансляция заключается в синтезе полипептидной цепи в соответствии с информацией, закодированной в матричной РНК. Аминокислотная последовательность выстраивается при помощи транспортных РНК, которые образуют с аминокислотами комплексы — аминоацил-тРНК. Каждой аминокислоте соответствует своя тРНК, имеющая соответствующий антикодон, «подходящий» к кодону мРНК. Во время трансляции рибосома движется вдоль мРНК, по мере этого наращивается полипептидная цепь. Энергией биосинтез белка обеспечивается за счёт АТФ.Готовая белковая молекула затем отщепляется от рибосомы и транспортируется в нужное место клетки. Для достижения своего активного состояния некоторые белки требуют дополнительной посттрансляционной модификации.

12)Стадии  трансляции: инициация. Процесс трансляции разделяют на инициацию — узнавание рибосомой стартового кодона и начало синтеза. элонгацию — собственно синтез белка. терминацию — узнавание терминирующего кодона (стоп-кодона) и отделение продукта.Синтез белка в большинстве случаев начинается с AUG-кодона, кодирующего метионин. Этот кодон обычно называют стартовым или инициаторным. Инициация трансляции предусматривает узнавание рибосомой этого кодона и привлечение инициаторной аминоацил-тРНК. Для инициации трансляции необходимо также наличие определённых нуклеотидных последовательностей в районе стартового кодона. Немаловажная роль в защите 5'-конца мРНК принадлежит 5'-кэпу. Существование последовательности, отличающей стартовый AUG от внутренних совершенно необходимо, так как в противном случае инициация синтеза белка происходила бы хаотично на всех AUG-кодонах.Процесс инициации обеспечивается специальными белками — факторами инициации (англ. initiation factors, IF; инициаторные факторы эукариот обозначают eIF, от англ. eukaryotes).Механизмы инициации трансляции у про- и эукариот существенно отличаются: прокариотические рибосомы потенциально способны находить стартовый AUG и инициировать синтез на любых участках мРНК, в то время как эукариотические рибосомы обычно присоединяются к мРНК в области кэпа и сканируют её в поисках стартового кодона.

13)Стадии  трансляции: терминация. цепи.Терминация белкового синтеза - исключительно ответственный этап в жизни клетки. Если ошибка при элонгации (замена одной аминокислоты на другую) во многих случаях проходит для клетки фенотипически незаметно, то ошибка при "чтении" терминирующего кодона как значащего ведет к сквозному чтению (readthrough), при котором синтез не заканчивается, а на С-конце белка возникает концевая аминокислотная последовательность, кодированная 3'- концом мРНК после терминирующего кодона. В этом случае белок может приобрести новые свойства, инактивироваться или деградировать, что неблагоприятно для клетки. Действительно, экспериментально показано [ Atkinson, ea 1993 ], что искусственно вызванное сквозное прочтение снижает жизнеспособность клеток. С другой стороны, если значащий кодон читается как терминирующий, то это приведет к появлению из-за преждевременной терминации недостроенных полипептидных цепей, лишенных С-конца, что также вызовет самые отрицательные последствия для клетки.Основополагающие работы, касающиеся терминации белкового синтеза, были опубликованы еще в конце 60-х годов. Тогда были установлены два факта, подтвердившиеся всеми дальнейшими исследованиями.Во-первых, терминация происходит на рибосомах в тот момент, когда в рибосбмном А-участке (иногда его называют еще декодирующим) находится один из трех терминирующих (или стоп) кодонов - UAA, UAG или UGA, а в Р-участке (или донорном) располагается пептидил-тРНК.Во-вторых, терминация зависит от присутствия в рибосомах особых белков, получивших название " факторы терминации " (polypeptide chain release factors; RF - у прокариот и eRF - у эукариот).

14.Стадии  трансляции: элонгация. Образование  полипептидной цепи.

Трансляцией называют осуществляемый рибосомой синтез белка изаминокислот на матрице информационной (или матричной) РНК (иРНК или мРНК).Процесс трансляции разделяют на:инициацию — узнавание рибосомой стартового кодона и начало синтеза.элонгацию — собственно синтез белка.терминацию — узнавание терминирующего кодона (стоп-кодона) и отделение продукта.В процессе наращивания полипептидной цепи принимают участие два белковых фактора элонгации. Первый (EF1a у эукариот, EF-Tu — у прокариот) переносит аминоцилированную (заряженную аминокислотой) тРНК в А (аминоацил)-сайт рибосомы. Рибосома катализирует образование пептидной связи, происходит перенос растущей цепи пептида с Р-сайтовой тРНК на находящуюся в А-сайте, пептид удлиняется на один аминокислотный остаток. Затем второй белок (EF2 у эукариот, EF-G — у прокариот) катализирует так называемую транслокацию. Транслокация — перемещение рибосомы по мРНК на один триплет, в результате которого пептидил-тРНК оказывается вновь в Р-сайте, а «пустая» тРНК из P-сайта переходит в Е-сайт (от слова exit). Цикл элонгации завершается, когда новая тРНК с нужным антикодоном приходит в A-сайт.В полипептидной цепи происходят расшифровка информации, закодированной с помощью генетического кода, и построение на матрице мРНК полипептидной цепи определенного белка. В этом процессе участвуют еще два вида РНК — рибосомальная РНК(рРНК) и транспортная РНК (тРНК).Для обоих видов РНК в геноме имеются многочисленные гены, на матрице которых эти РНК синтезируются. Принципиально транскрипция для рРНК и тРНК ничем не отличается от только что описанной транскрипции мРНК. В то же время рРНК и тРНК являются конечными продуктами. Таким образом, в геноме, кроме генов, контролирующих синтез всех белков организма, существуют гены, кодирующие тРНК, рРНК и ряд других типов РНК; тРНК обеспечивает связь между кодонами мРНК и аминокислотами будущей полипептидной цепи. Для каждой из 20 аминокислот существует не менее одной тРНК.

15. Уравнение Михаэлиса-Ментен и способы его модификации

  Это уравнение получило название уравнения Михаэлиса-Ментен.В случае, когда скорость реакции равна половине максимальной, Km = [S].Таким образом, константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата, при которой достигается половина максимальной скорости.Уравнение Михаэлиса-Ментен - основное уравнение ферментативной кинетики, описывающее зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата.Если концентрация субстрата значительно больше Km (S >> Km), to увеличение концентрации субстрата на величину Кm практически не влияет на сумму (Km + S) и её можно считать равной концентрации субстрата. Следовательно, скорость реакции становится равной максимальной скорости: V = Vmax. В этих условиях реакция имеет нулевой порядок, т.е. не зависит от концентрации субстрата. Можно сделать вывод, что Vmax - величина постоянная для данной концентрации фермента, не зависящая от концентрации субстрата.Если концентрация субстрата значительно меньше Km(S << Km), то сумма (Km + S) примерно равна Кm, следовательно, V = Vmax[S]/Km, т.е. в данном случае скорость реакции прямо пропорциональна концентрации субстрата (реакция имеет первый порядок).Vmах и Km - кинетические характеристики эффективности фермента.

16. Определение типа ингибирования ферментативной реакции.Типы ингибирования.Различают обратимое и необратимое ингибирование. Если ингибитор вызывает стойкие изменения пространственной третичной структуры молекулы фермента или модификацию функциональных групп фермента, то такой тип ингибирования называется необратимым. Чаще, однако, имеет место обратимое ингибирование, поддающееся количественному изучению на основе уравнения Михаэлиса-Ментен. Обратимое ингибирование в свою очередь разделяют на конкурентное и неконкурентное в зависимости от того, удается или не удается преодолеть торможение ферментативной реакции путем увеличения концентрации субстрата.Конкурентное ингибирование может быть вызвано веществами, имеющими структуру, похожую на структурусубстрата, но несколько отличающуюся от структуры истинного субстрата. Такое ингибирование основано на связывании ингибитора с субстратсвязывающим (активным) центром. Классическим примером подобного типа ингибирования является торможение сукцинатдегидрогеназы (СДГ) малоновой кислотой. Этот ферменткатализирует окисление путем дегидрирования янтарной кислоты (сукцината) в фумаровую.Если в среду добавить малонат (ингибитор), то в результате структурного сходства его с истинным субстратом сукцинатом (наличие двух таких же ионизированных карбоксильных групп) он будет взаимодействовать с активным центром с образованием фермент-ингибиторного комплекса, однако при этом полностью исключается перенос атома водорода от малоната. Структуры субстрата (сукцинат) и ингибитора(малонат) все же несколько различаются. Поэтому они конкурируют за связывание с активным центром, и степень торможения будет определяться соотношением концентраций малоната и сукцината, а не абсолютной концентрацией ингибитора. Таким образом, ингибитор может обратимо связываться сферментом, образуя фермент-ингибиторный комплекс. Этот тип ингиби-рования иногда называют ингибированием по типу метаболического антагонизма.