Определение предмета молекулярная биология

В эритроцитах содержится гемоглобин - комплекс белка глобина с небелковой железосодержащей частью - гемом.

Глобин имеет  четвертичную структуру.

Он состоит из двух альфа- и двух бета- полипептидных цепей (это названия цепей, не имеющие отношения к  их вторичной структуре). В сумме  это 574 аминокислоты. У всех здоровых людей на 6-ом месте от N-конца в бета-цепи находится полярная глутаминовая кислота ("-" заряженная). У больных серповидно-клеточной анемией вместо нее - неполярный валин.

Из 574 аминокислот  заменено 2.

Такой гемоглобин теряет растворимость, образуется волокнистый осадок, деформирующий эритроцит.

Серповидно-клеточная анемия - заболевание  генетическое. Причина - замена всего  одного нуклеотида в гене, кодирующем ß-цепь гемоглобина. Дети - рецессивные  гомозиготы по такому аллелю не доживают до двух лет. У гетерозигот 85% нормальных и 15% дефектных эритроцитов. Доминантные гомозиготы болеют малярией, гетерозиготы - не болеют.

Глобулярные и фибриллярные белки.

95% белков имеют гидрофобное  ядро.

5% фибриллярные белки. 

Подавляющее число глобулярных  белков растворимо. Большинство фибриллярных - нерастворимо ( α-кератины - на их долю приходится почти весь сухой вес волос, шерсти, рогов, копыт, ногтей, чешуи, перьев; коллаген - белок сухожилий, хрящей; фиброин - белок шелка).

Фибриллярные  белки содержат большую долю заряженных аминокислот, чем глобулярные - отдельные цепи растворимы, а их комплексы неполярны и нерастворимы

 

Определение: Белок - это отдельный полипептид или агрегат нескольких полипептидов, выполняющий биологическую функцию.

Полипетид - понятие химическое. Белок - понятие биологическое.

Например, иммуноглобулин состоит  из четырех полипептидных цепей, которые по отдельности не являются белками, белок - только их функциональный агрегат.

 

Функции белков

1. Структурная функция.

Белки входят в состав всех клеточных органелл: мембранных - плазмалемма, ядерная оболочка, эндоплазматическая или ретикулярная сеть (ЭР), комплекс Гольджи, лизосомы, пероксисомы, вакуоль, митохондрии, пластиды - и немембранных - хромосомы, рибосомы, клеточный центр (центриоли), реснички и жгутики, микрофиламенты.

2. Каталитическая функция.

Все ферменты - белки. Эта функция  в 1982 году перестала считаться уникальной. Выяснилось, что некоторые РНК  тоже обладают каталитической активностью. Их называют РНКзимами.

3. Защитная функция  (пока уникальна).

Антитела - это белки. Иммуноглобулины "склеивают" антигены и образуется преципитат

4. Регуляторная функция. 

На клеточном уровне: белки - репрессоры и белки - активаторы транскрипции.  
На организменном уровне: некоторые гормоны - белки.  
Например, инсулин - гормон поджелудочной железы. Регулирует переход глюкозы через плазмалемму. При недостаточной секреции инсулина развивается тяжелое заболевание – сахарный диабет. 
Соматотропин - гормон роста. Образуется в передней доле гипофиза.  
Там же образуется и адренокортикотропный гормон (АКТГ). Он действует на кору надпочечников, регулируя синтез стероидных гормонов.

5. Трансформация энергии.

Белки сечатки глаза родопсин и  ретинен трансформируют световую энергию  в электрическую. Актино-миозиновые комплексы в мышцах преобразуют энергию химических связей в механическую.

6. Транспортная функция.

Гемоглобин осуществляет транспорт О₂, СО₂.  
Трансферрин - транспорт железа.  
Системы пермеаз - это мембранные белки, которые переносят полярные соединения через мембрану как по, так и против градиента концентрации.

7. Энергетическая функция.

11 из 20 аминокислот, входящих в  состав белков, в организме человека "сгорают" с выделением энергии.  Это - заменимые аминокислоты. Они  могут быть синтезированы в  клетке из продуктов расщепления углеводов и липидов

8. Питательная функция. 

а) Поставка незаменимых аминокислот. У человека 9 из 20 аминокислот не могут быть синтезированы в организме. Они должны поступать извне.

Понятие "заменимые  и незаменимые аминокислоты" - видоспецифическое и касается только животных и грибов.

б) Запасные белки для развития зародыша и вскармливания младенца. Например, казеин - белок молока, овальбумин - яичный белок, глиадин - белок зерен  пшеницы.

9. Буферная функция. 

Любой белок - амфотерный полиэлектролит. Белки способствуют поддержанию определенных значений рН в разных отсеках клетки, обеспечивая этим компартментализацию.

 

 

Определение: Генетический код - это система записи информации о последовательности расположения аминокислот в белках с помощью последовательности расположения нуклеотидов в ДНК.

 

Поскольку ДНК  непосредственного участия в  синтезе белка не принимает, то код  записывается на языке РНК. В РНК  вместо тимина входит урацил.

 

Свойства  генетического кода

1. Триплетность

Каждая  аминокислота кодируется последовательностью из 3-х нуклеотидов.

Определение: триплет или кодон - последовательность из трех нуклеотидов, кодирующая одну аминокислоту.

 

Код не может быть моноплетным, поскольку 4 (число разных нуклеотидов в  ДНК) меньше 20. Код не может быть дуплетным, т.к. 16 (число сочетаний и перестановок из 4-х нуклеотидов по 2) меньше 20. Код может быть триплетным, т.к. 64 (число сочетаний и перестановок из 4-х по 3) больше 20.

2. Вырожденность. 

Все аминокислоты, за исключением  метионина и триптофана, кодируются более чем одним триплетом:

2 АК по 1 триплету = 2 
9 АК по 2 триплета = 18 
1 АК 3 триплета = 3 
5 АК по 4 триплета = 20 
3 АК по 6 триплетов = 18 
Всего 61 триплет кодирует 20 аминокислот.

3. Наличие межгенных знаков препинания.

Определение: ген- это участок ДНК, кодирующий одну полипептидную цепь или одну молекулу tРНК, rРНК или sРНК.

Гены tРНК, rРНК, sРНК белки не кодируют.

В конце каждого гена, кодирующего полипептид, находится, по меньшей мере, один из 3-х терминирующих кодонов, или стоп-сигналов: UAA, UAG, UGA. Они терминируют трансляцию.

Условно к знакам препинания относится  и кодон AUG - первый после лидерной последовательности. (См. лекцию 8) Он выполняет функцию заглавной буквы. В этой позиции он кодирует формилметионин (у прокариот).

4. Однозначность. 

Каждый триплет кодирует лишь одну аминокислоту или является терминатором трансляции.

Исключение составляет кодон AUG. У  прокариот в первой позиции (заглавная буква) он кодирует формилметионин, а в любой другой - метионин.

5. Компактность, или отсутствие  внутригенных знаков препинания.

Внутри гена каждый нуклеотид входит в состав значащего кодона.

В 1961г. Сеймур Бензер и Френсис Крик экспериментально доказали триплетность кода и его компактость.

Суть эксперимента: "+" мутация - вставка одного нуклеотида. "-" мутация - выпадение одного нуклеотида.  
Одиночная "+" или "-" мутация в начале гена портит весь ген.  
Двойная "+" или "-" мутация тоже портит весь ген.  
Тройная "+" или "-" мутация в начале гена портит лишь его часть.  
Четверная "+" или "-" мутация опять портит весь ген.

Эксперимент доказывает, что 
код триплетен и внутри гена нет знаков препинания. Эксперимент был проведен на двух рядом расположенных фаговых генах и показал, кроме того, 
наличие знаков препинания между генами.

 

 

6. Универсальность. 

Генетический  код един для всех живущих на Земле  существ.

Это является сильнейшим свидетельством в пользу единства происхождения и эволюции.

В 1979г. Беррел открыл идеальный код  митохондрий человека.

Определение: идеальным называется генетический код, в котором выполняется правило вырожденности квазидублетного кода:  
Если в двух триплетах совпадают первые два нуклеотида, а третьи нуклеотиды относятся к одному классу (оба - пурины или оба - пиримидины), то эти триплеты кодируют одну и ту же аминокислоту.

Из этого правила в универсальном  коде есть два исключения. Оба отклонения от идеального кода в универсальном  касаются принципиальных моментов: начала и конца синтеза белка:

Кодон	Универсальный код	Митохондриальные коды
		Позвоночные	Беспозвоночные	Дрожжи	Растения
UGA	STOP	Trp	Trp	Trp	STOP
AUA	Ile	Met	Met	Met	Ile
CUA	Leu	Leu	Leu	Thr	Leu
AGA	Arg	STOP	Ser	Arg	Arg
AGG	Arg	STOP	Ser	Arg	Arg

7. Помехоустойчивость.

Определение: Мутации  замен нуклеотидов, не приводящие к  смене класса кодируемой аминокислоты, называют консервативными. Мутации замен нуклеотидов, приводящие к смене класса кодируемой аминокислоты, называют радикальными.

 

В каждом триплете можно провести 9 однократных замен. Общее количество возможных замен нуклеотидов - 61 по 9 = 549. Из них:

23 замены нуклеотидов приводят  к появлению кодонов - терминаторов  трансляции.

 
134 замены не меняют кодируемую  аминокислоту. 
230 замен не меняют класс кодируемой аминокислоты. 
162 замены приводят к смене класса аминокислоты, т.е. являются радикальными.  
Из 183 замен 3-его нуклеотида, 7 приводят к появлению терминаторов трансляции, а 176 - консервативны. 
Из 183 замен 1-ого нуклеотида, 9 приводят к появлению терминаторов, 114 - консервативны и 60 - радикальны. 
Из 183 замен 2-го нуклеотида, 7 приводят к появлению терминаторов, 74 - консервативны, 102 - радикальны.

Итак: 364/162=2.25 (отношение  числа консервативных замен к  числу радикальных замен) - показатель помехоустойчивости генетического кода.

8. Неперекрываемость. 

В 1956г. Георгий Гамов  предложил вариант перекрываемого кода. Согласно Гамовскому коду, каждый нуклеотид, начиная с третьего в  гене, входит в состав 3-х кодонов. Когда генетический код был расшифрован, оказалось, что он неперекрываем, т.е. каждый нуклеотид входит в состав лишь одного кодона.

Достоинства перекрываемого генетического  кода: 
компактность, меньшая зависимость структуры белка от вставки или делеции нуклеотида.

Недостаток:  
большая зависимость структуры белка от замены нуклеотида и ограничение на соседей.

В 1976г. была секвенирована ДНК фага φХ174. У него одноцепочечная кольцевая  ДНК, состоящая из 5375 нуклеотидов. Было известно, что фаг кодирует 9 белков. Для 6 из них были определены гены, располагающиеся друг за другом.

Выяснилось, что есть перекрывание. Ген Е полностью  находится внутри гена D. Его инициирующий кодон появляется в результате сдвига считывания на один нуклеотид. Ген J начинается там, где кончается ген D. Инициирующий кодон гена J перекрывается с терминирующим кодоном гена D в результате сдвига на два нуклеотида. Конструкция называется "сдвиг рамки считывания" на число нуклеотидов, некратное трем. На сегодняшний день перекрывание показано только для нескольких фагов.

Информационная емкость ДНК

На Земле живет 6 миллиардов человек. Наследственная информация о них  заключена в 6х10⁹ сперматозоидах. По разным оценкам у человека от 30 до 50 тысяч генов. У всех людей ~ 30х10¹³ генов или 30х10¹⁶ пар нуклеотидов, которые составляют 10¹⁷ кодонов. Средняя книжная страница содержит 25х10² знаков. ДНК 6х10⁹ сперматозоидов содержит информацию, равную по объему примерно 4х10¹³ книжных страниц. Эти страницы заняли бы объем 6-и зданий НГУ. 6х10⁹ сперматозоидов занимают половину наперстка. Их ДНК занимает менее четверти наперстка.

Определение: транскрипция - это синтез всех видов РНК по матрице ДНК, осуществляемый ферментом ДНК-зависимой РНК-полимеразой.

У прокариот синтез всех видов РНК  осуществляется одним и тем же ферментом.

У эукариот - 3 ядерные РНК-полимеразы, митохондриальные РНК-полимеразы, хлоропластные  РНК-полимеразы.

Субстратами для РНК-полимераз  служат рибонуклеозид-трифосфаты (активированные нуклеотиды). Весь процесс транскрипции осуществляется за счет энергии акроэргических связей актвированных нуклеотидов.

 

Принципы  транскрипции:

1. Комплементарность.

2. Антипараллельность.

3. Униполярность.

4. Беззатравочность.

5. Асимметричность.

РНК синтезируется комплементарно и антипараллельно транскрибируемой цепи ДНК. Рост цепи РНК идет только в направлении 5' 3'. Для начала синтеза РНК фермент не нуждается в поли- или олигонуклеотидной затравке.

Первый нуклеотид  в РНК всегда пурин в форме  трифосфата.

 

 

 

Субъединичный состав РНК-полимеразы Е.coli

РНК-полимераза Е.coli - белок с четвертичной структурой. Одновременно в клетке присутствует около 7000 молекул РНК-полимеразы.

Субъединичный состав фермента: (2α)ββ’σ - holo-фермент (полный фермент). Без σ-фактора это core-фермент (2α)ββ’σ.

 

σ (сигма) - фактор - сменный фактор специфичности.

 

Только holo-фермент обладает высоким сродством к специфической последовательности нуклеотидов - промотору, сродство к остальным случайным последовательностям ДНК у него снижено в 10000 раз. У core-фермента одинаковое сродство к любой последовательности нуклеотидов.

Сам по себе - фактор обладает наименьшим сродством к ДНК по сравнению с другими субьединицами РНК-полимеразы, однако он придает holo-ферменту такую конформацию, которая обладает повышенным сродством к промотору.

Как только произошла инициация  транскрипции, σ -фактор отделяется. Элонгация - продолжение синтеза РНК, и терминация - его остановка, осуществляются core-ферментом.

Стадии узнавания и связывания, а также инициации осуществляются holo-ферментом. Элонгация и терминация осуществляются core-ферментом.

Две α субъединицы - каркас РНК-полимеразы. К ним крепятся остальные субъединицы.

β’- субъединица отвечает за прочное связывание с ДНК за счет кластера положительно заряженных аминокислот.

В β- субъединице находятся два каталитических центра. Один отвечает за инициацию, а другой - за элонгацию. Один центр работает в holo-, а другой - в core- ферменте.

Особенности структуры промотора

Для изучения структуры промоторов провели следующий эксперимент. При оптимальных условиях связывания получили комплекс РНК-полимеразы с ДНК. Этот комплекс обработали ДНК-азой, и таким образом гидролизовали всю ДНК, незащищенную РНК-полимеразой. После этого отделили РНК-полимеразу от оставшихся фрагментов ДНК. Опять создали оптимальные условия для образования комплекса. Комплекс не образовывался.