Определение предмета молекулярная биология

Альтернативный  сплайсинг mРНК кальцитонинового гена у млекопитающих (крыса)

Во всех клетках есть кальцитониновый  ген, но в клетках щитовидной железы он экспрессируется в виде гормона кальцитонина, а в клетках гипофиза - нейропептида CGRP (пептида, имеющего отношение к гену кальцитонина). Ген один, а белки получаются разные в результате сплайсинга mРНК и процессинга полипептидов. В клетках других тканей этот ген не экспрессируется.

 

Сплайсинг осуществляется белковыми  комплексами - сплайсосомами, в которых  помимо ферментов, вырезающих и сшивающих  участки про-mРНК, имеются белки, придающие про-mРНК нужную конформацию, и несколько sPНК. Сплайсосома непосредственно связана с ферментами, занимающимися полиаденилированием.

Автосплайсинг

Автосплайсинг открыт Томасом Чеком (США) в 1982 году.

Он работал с инфузорией Tetrаchymenа thermophyla. У этой инфузории образуется 35S про-rРНК длиной 6400 нуклеотидов. Без участия дополнительных соединений белковой природы из этой про-rРНК вырезается внутренний участок длиной в 414 нуклеотида. Два экзона сшиваются с образованием 26S rРНК. Единственное требование - определенная концентрация ионов магния. Про-rРНК имеет третичную структуру и обладает каталитичекой активностью. Впервые было показано, что каталитической активностью обладают не только белки.

 

Определение: РНК-зимы - РНК с каталитической активностью.

Сегодня описано несколько десятков РНК-зимов.

 

Малые РНК

sРНК обнаружены в количестве 10³-10⁵ копий на клетку. Поскольку в большинстве случаев эти РНК обогащены урацилом, они называются U1, U2... Их размер от 100 до 300 нукл. Все они кодируются в ядре, но работают как в ядре (small nuclear - S_N), так и в цитоплазме (small cytoplasmic - S_C). SNURPS - РНП (рибонуклеопротеидные комплексы) в ядре. snРНК входят в состав РНП, участвующих в полиаденилированиии и сплайсинге.

SCURPS - РНП в цитоплазме. Входят в состав информосом.

Малая РНК U4 присутствует в комплексах, участвующих в полиаденилировании. Если получить антитела к белкам, связывающимся  с U4, то не происходит полиаденилирования и сплайсинга.

При красной  волчанке (аутоимунном заболевании) вырабатываются антитела к белкам комплекса с U4.

Гистоновая mРНК не полиаденилируется  потому, что sРНКU7, которая комплементарна 3'-концу гистоновой mРНК, защищает ее от полиаденилирования.

Малые РНК U1, U2, U4, U5, U6 входят в состав сплайсосомы.

 

Репликация ДНК

Определение: процесс, осуществляемый комплексом ферментов  и белков, выполняющих топологическую функцию, суть которого в образовании  идентичных копий ДНК для передачи генетической информации в поколениях клеток и организмов, называют репликацией ДНК.

Принципы  репликации

1. Комплементарность.

2. Антипараллельность.

3. Униполярность.

4. Потребность в затравке.

5. Прерывистость.

6.Полуконсервативность.

Первые три принципа можно сформулировать в одной фразе:

Синтез каждой дочерней цепи ДНК идет комплементарно и антипараллельно матричной цепи и всегда в направлении 5' 3'.

 

Доказательство  полуконсервативного характера  репликации

Для выяснения вопроса о характере расхождения цепей по дочерним молекулам Мэтт Мезельсон и Фрэнк Сталь в 1958г. разработали метод равновесного центрифугирования в градиенте плотности CsCl. .

ДНК разделяется  не по молекулярным весам, а по удельной плотности.

E. сoli выращивали на протяжении нескольких поколений на среде, содержащей тяжелый изотоп азота (N₁₅), для того, чтобы вся ДНК была "тяжелой". Перед очередным раундом деления клетки синхронизировали. При этом в среде заменяли N₁₅ на легкий изотоп N₁₄ с тем, чтобы вновь синтезированные цепи были "легкими". После репликации ДНК выделяли и центрифугировали в градиенте плотности CsCl.

 

Полуконсервативность  означает, что каждая дочерняя ДНК  состоит из одной матричной цепи и одной вновь синтезированной.

 

Равное распределение "тяжелых" и "легких" цепей между всеми молекулами исключало возможность консервативного способа, согласно которому одна дочерняя клетка получает материнскую ДНК, а другая - вновь синтезированную, обе цепи которой являются новыми.

Клетки второго поколения содержали как полностью "легкие" молекулы, так и "гибридные", состоящие из одной "легкой" и одной "тяжелой" цепи, аналогичные молекулам первого поколения. Этот факт исключал возможность дисперсного механизма, согластно которому куски материнской ДНК случайным образом распределяются между дочерними молекулами.

П

Понятие о матрице и затравке

Продукты, образуемые в ферментативной системе in vitro.

Во всех случаях матрицей для  синтеза новых цепей служит одноцепочечная ДНК. Затравкой является 3'-гидроксильный конец двуцепочечной ДНК, причем он должен быть спарен с матрицей.

В том случае, если эндонуклеаза вносила  ники с 3'-фосфатным концом, ДНК не являлась активированной.

 

Прямым доказательством того, что  затравка - 3'-гидроксильный конец, является эксперимент с дидезоксинуклеозидтрифосфатом.

Если такой активированный нуклеотид сделать меченым по α-фосфату, то он включается в растущую полимерную цепь и всегда обнаруживается на ее 3'-конце. Это говорит о том, что он сам включается, но дальнейший рост цепи невозможен, т.к. нет 3'-гидроксильного конца.  

Это также доказывает и униполярность  репликации в направлении 5' 3'.

Схема непрерывной  антипараллельной репликации in vivo по Корнбергу

1960г. Гипотетическая модель.

Суть предположения: неизвестный  фактор денатурирует концы линейной молекулы, 3'-ОН-концы загибаются и  служат затравками для работы ДНК-полимеразы. Фермент осуществляет денатурацию  матричной ДНК по мере продвижения и синтеза дочерних цепей. На выходе - дочерние молекулы, которые короче на загнутый конец, т.к. эндонуклеаза вносит разрыв в материнскую цепь.

Схема непрерывной  параллельной репликации Джона Кэрнса

1963г. Авторадиография  

Бактерии выращивались на среде с радиоактивным H₃-тимидином в течение 5-и, 10-и, 15-и мин., после чего проводили авторадиографию.  

Ширина полос засветки соответствовала  двум меченым нитям ДНК (если помечена одна цепь, то полоса будет получаться уже).

В модели допускалось наличие фермента, способного вести синтез в направлении 3' 5'. Такой фермент не найден и сегодня.

 

Модель неверна, однако, она побудила искать новые ДНК-полимеразы и в Е. coli были найдены еще две: II и III.

 

 

Сравнительные характеристики ДНК-полимераз E. сoli

Функция	ДНК-полимераза I	ДНК-полимераза II	ДНК-полимераза III
Полимеризация в 5' 3' направлении	+	+	+
Гидролитическая активность 3' 5'	+	+	+
Гидролитическая активность 5' 3'	+	-	-
Потребность в матрице-затравке:
Нативная двуцепочечная  ДНК	-	-	-
Одноцепочечная ДНК  с олигонуклеотидной затравкой	+	-	-
2-х цепочечная ДНК  с ником	+	-	-
или с пробелом меньше 100 нуклеотидов	+	+	+
или с пробелом больше 100 нуклеотидов	+	-	-
Оптимальная концентрация KCl	Активность
20мМ	60%	60%	100%
50мМ	80%	100%	50%
100мМ	100%	70%	10%
150мМ	80%	50%	0%
Влияние 10% этанола	40%	45%	200%
Молекулярный вес (кДа)	109	120	субъединич.состав
Число оборотов, принимая за единицу 667 нукл/мин.	1	0.05	15
Число молекул на клетку	250	100	20

К репликации имеют отношение полимеразы I и III.

Причем именно полимераза III является репликазой, т.е. она синтезирует in vivo новые цепи ДНК.

Участие ДНК-полимеразы I необходимо. У нее вспомогательная, репаративная функция.

ДНК-полимераза II имеет отношение  лишь к репарации.

Схема прерывистой  антипараллельной репликации Рейджи Оказаки 

1968 г.

Исходные посылки: все данные Корнберга, полученные в ферментативной системе in vitro, и "картинки" Кэрнса верны ( но картинки неправильно интерпретированы).

Оказаки специально разработал два  новых метода исследования.

1. Метод импульсного мечения.  
До Оказаки метку давали в культуральную среду и быстро начинали отмывать клетки, но минимальное время подачи метки было 5 мин. Оказаки через нужный момент времени после добавления меченого тимидина давал 1000-кратный избыток холодного (немеченого) тимидина. Таким образом, метка включается только в течение очень короткого времени.

Оказаки считал, что время Кэрнса (5 мин.) очень велико для получения  истинной картины происходящего  при репликации.

2. Центрифугирование в щелочном градиенте сахарозы.  
Сахароза разводится на щелочи. В щелочной среде происходит денатурация ДНК. В этом случае короткие фрагменты ДНК, если они есть, отделяются от длинных. После этого их можно выявить при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы, разделяющем молекулы по молекулярному весу.

Оказаки предположил, что синтез ДНК идет короткими фрагментами и что короткие фрагменты должны сшиваться.

Сшиваются они лигазой. ДНК-лигаза была обнаружена как у прокариот, так и у эукариот. У E. сoli были найдены мутанты по лигазе.

Оказаки провел эксперимент на бактериях, зараженных фагом Т4, у которого есть своя термочувствительная лигаза, которая работает при 20 С и не работает при 43 С. Если в клетку попадает фаговая ДНК, то клетка переключается на репликацию ДНК фага.

Клетки заражали фагом Т4, давали импульсную метку Н₃-тимидин и выращивали при двух температурах: 20 С и 43 С. Потом проводили центрифугирование в щелочном градиенте сахарозы.

 

Лигаза E. coli нуждается в коферменте НАД, а лигаза фага - в АТФ. Если E.coli не давать никотиновую кислоту (предшественник НАД), бактериальная ДНК реплицируется, но не сшивается.

Прерывистость репликации показана для всех объектов, кроме фагов, содержащих одноцепочечную ДНК.

 

У некоторых  фагов и вирусов прерывистый  синтез идет по обеим цепям. У бактерий и высших организмов одна цепь образуется непрерывно, а другая - прерывисто (лидирующая и запаздывающая цепи).

Размер фрагментов Оказаки видоспецифичен и составляет для фагов 1000-2000 нукл., E. сoli - 1000 нукл., для эукариот - 200-400 нукл.

У фага Т7 обе цепи ДНК тоже реплицируются прерывисто. Они имеют разную плотность (в одной больше пуринов). Цепи были разделены в градиенте плотности CsCl и помещены на две колонки. Была осуществлена ковалентная привязка, поэтому они не могли сойти со смолы. Потом провели репликацию в условиях импульсного мечения. Пропустили все фрагменты через первую колонку. Выход был 50%. Остальные прогнали через вторую колонку. Выхода не было. Таким образом, было показано, что фрагменты комплементарны обеим матричным цепям. Значит, фрагменты образуются по обеим цепям

 

 

Схема размножения  фага М13

1974 г. Оказаки. 

 

Рифампицин - ингибитор бактериальной РНК-полимеразы (на стадии инициации).

Хлорамфеникол - ингибитор трансляции на бактериальных рибосомах.

Если одновременно с заражением E. сoli фагом добавить хлорамфеникол, то блокируются трансляция, репликация II и сборка фагов.

Если подействовать рифампицином, то блокируется не только транскрипция и все следующие процессы, но и репликация I.

Вывод: бактериальная РНК-полимераза участвует в репликации ДНК фага.

Вся фаговая ДНК составляет ~6000 нукл.

Определение: origin (ori) - район начала репликации.

В районе ori (начало репликации) имеется 4 шпильки. Эти шпильки опознаются РНК-полимеразой, и вторая шпилька используется в качестве матрицы. По мере образования РНК шпилька плавится. Образуется РНК-затравка длиной 24 нукл., 3'-конец которой используется ДНК полимеразой III.

Когда 3'-конец синтезируемой цепи ДНК "утыкается" в 5'-конец РНК-затравки, ДНК-полимераза III вытесняется ДНК-полимеразой I, которая, обладая 5' 3' гидролитической активностью, "съедает" РНК-затравку, одновременно продолжая синтез ДНК. Когда затравка (РНК) съедена, ДНК-полимераза I вытесняется лигазой, которая сшивает концы ДНК.  

Все эти ферменты (ДНК-полимераза III, ДНК-полимераза I, лигаза) входят в состав реплисомы. Они представляют единый белковый комплекс, который реагирует изменением конформации на выполнение очередной функции.

Протяженная (более 100 нукл.) одноцепочечная ДНК-матрица может быть использована ДНК полимеразой III, когда полимераза III представлена в форме holo-фермента. Помимо субъединицы , обладающей полимеразной активностью, в holo-фермент входит еще несколько субъединиц, обеспечивающих высокую процессивность синтеза ДНК.

Фаг

X174

Репликация ДНК этого фага не зависит от рифампицина.

Здесь работает не обычная РНК-полимераза, а особый фермент - праймаза. Он умеет делать только РНК-затравку.

Праймаза нуждается в дополнительных факторах - белках препрайминга. Точно так же (с помощью праймазы и белков препрайминга) образуются РНК-затравки при репликации ДНК E. сoli.