Определение предмета молекулярная биология

Прямой корреляции между количеством ДНК и эволюционной продвинутостью организма нет.

Так, например, у малярийного плазмодия 0.06 пг ДНК в ядре, а у амебы 490 пг. Большое количество ДНК не обязательно  приносит качественно новую информацию. Амеба пошла на увеличение количества ДНК для увеличения размеров ядра и самой клетки. Генов у нее  меньше, чем у плазмодия, но они копированы много раз. У малярийного плазмодия генов больше, чем у амебы, а ДНК меньше для максимальной компактности. Малые размеры ядра и самого одноклеточного организма позволяют ему быть внутриклеточным паразитом.

У африканской двоякодышащей рыбы ДНК в 15 раз, а у амебы в 70 раз больше, чем у человека.

"Избыточность" эукариотического генома 

На ~ 10⁶ пар нуклеотидов у бактерий приходится ~5 тыс. генов. На  ~10⁹ пар нуклеотидов у млекопитающих ~50 тыс. генов.

Минусы "избыточной" ДНК:

- увеличение времени синтеза  ДНК;

- cложнее организовывать удвоение  ДНК;

- высокая энергоемкость - на 1 нуклеотид  для включения в цепь ДНК  нужно затратить ~60 молекул АТФ.

Неопределенное следствие:

- благодаря зависимости размера  ядра от количества ДНК происходит увеличение размеров клетки.

Плюсы "избыточной" ДНК:

- возникает возможность создания  сложного регуляторного аппарата, позволяющего поднять организм  на более высокий эволюционный  уровень. 

Причины избыточности:

1. Большой размер генов (за счет наличия интронов).

2. Присутствие повторенных последовательностей.  
Повторяются и гены, и некодирующие участки. У эукариот некоторые последовательности повторены сотни и тысячи раз.

3. Наличие большого числа некодирующих  последовательностей, часть из которых выполняет регуляторную функцию при транскрипции, а часть - необходима для компактизации генома.

 

Компактность  генома эукариот

Компактность - другое принципиальное отличие генома эукариот от прокариотического генома.

При средней разнице размеров геномов на 3 порядка, линейные размеры эукариотических хромосом соизмеримы с длиной ДНК прокариот.

Выделяют, по крайней мере, 4 уровня компактизации ДНК. При этом нить ДНК "укорачивается" в 10000 раз.

Это все равно, что нить, длиной с Останкинскую башню (500 м), уложить в спичечный коробок (5см).

Два первых уровня компактизации эукариотического генома обеспечиваются гистонами.

Общая характеристика гистонов

Гистоны - основные белки. 
Все они обогащены лизином и аргинином - положительно заряженными аминокислотами.  
Выделяют 5 фракций гистонов.  
Нарабатывается их очень много - 60 млн. молекул каждой фракции на клетку.

Фракция	Лизин	Аргинин	лиз./арг	осн.АК/кис.АК	Мол. вес (Да)
Н1 (очень богатая лизином)	29%	1%	>20	5.4	23000
Н2В (умернно богатая лизином)	16%	6%	~2.5	1.7	13774
Н2А (умеренно богатая лизином и аргинином)	11%	9%	~1	1.4	13960
Н4 (богатая аргинином и глицином)	11%	14%	~0.8	2.5	11282
Н3 (очень богатая аргинином); в ней есть цистеин, а в других - нет	10%	13%	~0.7	1.8	15348

Все гистоны, кроме Н1, черезвычайно консервативны в эволюционном отношении (у коровы и клевера разница в Н2А всего в одну аминокислоту!).

 

Следовательно, эти белки выполняют принципиальную функцию, которая у всех эукариот обеспечивается одинаково.

 

Любая мутация  в гистоновых генах летальна.

Н1 - очень вариабельная фракция. Этот гистон различен не только у видов, но даже у одного организма, в зависимости  от стадий онтогенеза.

В гистонах лизин и аргинин кластированы. Средняя часть гистона содержит гидрофобные аминокислоты.

Положительно заряженные аминокислоты гистонов обеспечивают электростатические взаимодействия с ДНК. 
Центральная часть необходима для взаимодействия гистонов между собой.

Четыре  уровня компактизации ДНК

1. Нуклеосомный.

В основе нуклеосомы лежит гистоновый октамер.

Расположение гистонов не случайно. Каждая молекула представлена дважды. Они образуют кор (серцевину) нуклеосомы. На кор наматывается ДНК - 1.75 левых витка спирали.

Определение: нуклеосомой называется повторяющийся структурный элемент хроматина, содержащий гистоновый октамер и ~180 п.н. ДНК.

Непосредственно с октамером контактирует 145 п.н. и 20-30-40 п.н. между нуклеосомными  корами.

Нуклеосомный  уровень упаковки свойственен всей эукариотической ДНК, он дает укорочение в 7 раз. Диаметр увеличивается с 20 Å до 110 Å.

Гистоновые октамеры "скользят" по ДНК.

При репликации снимается и этот уровень компактизации. При транскрипции нуклеосомы сохраняются.

2. Супербидный, или  соленоидный.

Фактически обеспечивается Н1 гистоном.

Н1 взаимодействует с октамерами, сближает их, и еще на него наматывется ДНК. Образуется супербид.

Происходит сокращение линейного размера ДНК в 6-10 раз. Диаметр увеличивается до 300Å.

Этот уровень  компактизации, как и первый, не зависит  от первичной структуры ДНК.

3. Петлевой уровень.

Обеспечивается негистоновыми  белками.

Они узнают определенные последовательности ДНК и связываются с ними и  друг другом, образуя петли по 20-80 тыс. п.н.  

Петля обеспечивает экспрессию гена, т.е петля является не только структурным, но и функциональным образованием.

Есть участки, в которых нет петель.Укорочение за счет петель проходит в 20-30 раз. Образуются и петлевые домены. Диаметр увеличивается  до 700Å.

4. Метафазная хромосома. 

Метафазная хромосома  уже удвоена. Она состоит из двух хроматид. Каждая из них содержит одну молекулу ДНК.

Сюда входят белки ядерной ламины, серия белковых нитей, сопряженных  с ядерной оболочкой и пронизывающих  все ядро.

Модификации гистонов очень сильно влияют на компактизацию  ДНК.

Гистоны могут метилироваться, фосфорилироваться (по серину, треонину, тирозину), т.е. аминокислотные остатки легко модифицируются. Кроме того, возможно алкилирование и ацетилирование гистонов.

Геном высших эукариот А-Т типа (пары А-Т преобладают), низших эукариот - Г-Ц типа. У человека соотношение (Г+Ц)/(А+Т) = 0.45. У разных типов бактерий диапазон соотношения А-Т пар и Г-Ц пар велик.

Чем больше в  геноме А-Т пар, тем больше возможностей для изменения вторичной структуры  ДНК. При суперспирализации ДНК  А-Т богатые участки плавятся в первую очередь.

Основы  метода ренатурации ДНК 

ДНК обрабатывают ультразвуком. При  этом она деградирует на двуцепочечные  куски одинакового размера.

Затем смесь денатурируют и медленно охлаждают.

При температуре на 20 С ниже, чем температура плавления ДНК, идет восстановление вторичной структуры (ренатурация).

Если последовательности часто встречаются, то они ренатурируют быстрее.

В процессе ренатурации выделяют две стадии:

1. Бимолекулярная  стадия нуклеации.  
Образуется несколько "ядер"- участков спаривания.  
Описывается реакцией второго порядка ( ).

2. Мономолекулярная стадия замыкания. 
Скорость реакции пропорционально первой степени концентрации ДНК.  
Это дальнейшее образование водородных связей - замыкание.

Процесс ренатурации  описывается уравнением: ,  
где k - константа скорости ренатурации, 
С - концентрация одноцепочечной ДНК.

В нулевой момент времени  .

Тогда .

Если  , то , и это полуренатурация.

Таким образом мы получили характеристику для описания разных молекул ДНК или их частей.

По значению можно выделить 3 фракции:

1. Быстрые повторы.

меньше 0,01 .

Частота встречаемости на гаплоидный геном больше 10⁵. 

2. Умеренные повторы. 

от 0,01 до 1000 .

Частота встречаемости на гаплоидный геном больше 10, но меньше 10⁵.

3. Уникальные последовательности.

больше 1000 .

Частота встречаемости меньше 10 раз  на геном.

Есть отдельные  последовательности, которые по значению относятся к одному классу, а по частоте встречаемости - к другому. Это - палиндромы. Они ренатурируют мгновенно, т.к. отсутствует поиск комплементарной цепи, а их встречаемость в геноме может быть низка.

Значение  у палиндромов такое же, как и у быстрых повторов, а встречаемость, как у уников или умеренных повторов. У некоторых организмов, например, у черепах, 20% ДНК - палиндромы. В среднем у животных от 2% до 12% генома приходится на палиндромы. У растений - от 1% до 4% (у пшеницы 3 млн. обращенных повторов). Они могут содержать от нескольких десятков до десятков тысяч нуклеотидов. Наиболее часто палиндромы встречаются в регуляторных участках генов.

Гены tРНК - часто  встречаемые палиндромы.

 

Быстрые повторы

К быстрым повторам относится сателлитная  ДНК.

Особенности:

1. В этой короткой последовательности (6-10 нукл.) отсутствует один из  нуклеотидов. Отсюда следует,  что эта ДНК не может быть  кодирующей, она никогда не транслируется. Встречается в конститутивном гетерохроматине.

Хромосома не гомогенна. В ней чередуются участки гетерохроматина (более  плотный) и эухроматина (не плотные  участки). В основном гены располагаются  в эухроматине. Но встречаются и  в гетерохроматиновых районах.

В зависимости от стадий клеточного цикла один и тот же участок  хромосомы может быть в состоянинии  как гетеро-, так и эухроматина. Такие участки хромосом называют факультативным гетерохроматином.

Участки, которые всегда уплотнены - конститутивный гетерохроматин. В нем, как правило, генов нет.

2. Сателлитная ДНК обязательно располагается в центромерном районе.

В местах расположения сателлитной  ДНК возможна максимальная компактизация. В конститутивном гетерохроматине  все четыре уровня упаковки ДНК представлены даже в интерфазе.

По сателлитной  ДНК происходит кроссинговер между  гомологичными хромосомами.

3. Сателлитная ДНК всегда располагается  тандемно по 100-200 единиц в блоке.  Образуются длинные последовательности  в геноме.

4. У недавно образовавшихся на одной территории близких видов сателлитная ДНК заведомо разная.

Это обеспечивает бесплодие возможных межвидовых гибридов.

 

Умеренные повторы

К умеренным повторам относят как  транскрибируемые и транслируемые, так и только транскрибируемые, но нетранслируемые последовательности ДНК и регуляторные участки.

Умеренные повторы
гены		регуляторные участки
транскрибируемые и   транслируемые  Гены белков рибосом, гистоновые гены, гены мембранных белков, цитоскелетных белков, гены иммуноглобулинов	транскрибируемые, но не   нетранслируемые Гены rРНК, sРНК, tРНК	энхансерные модули, ori репликации, промоторы  и терминаторы транскрипции

Гены tРНК в  среднем повторяются в геноме 5 тыс. раз. Гены sРНК - сотни тысяч  раз.

Уникальные  гены

У человека, по разным оценкам, 30-50 тыс. генов. Большинство генов - уникальны. Но даже в них есть повторяющиеся элементы. Это - некоторые экзоны.

 

Все гены разделяют на гены "домашнего  хозяйства" и гены "роскоши".

Гены "домашнего  хозяйства" кодируют то, что всегда нужно любой клетке независимо от ткани.

По разным оценкам таких генов  у человека 10-20 тыс. Это гистоновые гены, гены tРНК, rРНК и т.п. Гены "роскоши", которых заведомо больше в 2-3 раза, это  гены, которые экспрессируются в  клетках определенных тканей и в  определенное время. Например, все гены белковых гормонов - гены "роскоши".

Другая  классификация генов 

1. Уникальные гены, имеющие специализированную функцию.

Например, глобиновый, инсулиновый  и другие гены. Они экспрессируются  лишь в определенных клетках.

2. Уникальные гены, обладающие общими функциями, экспрессирующиеся в подавляющем большинстве клеток.

Эти гены плохо изучены.

3. Множественные сгруппированные гены.

Это гены rРНК, часть генов tРНК, часть  гистоновых генов.

4. Множественные рассеянные гены.

Это оставшаяся часть гистоновых генов, оставшиеся гены tРНК и большинство генов sРНК, а так же МДГ (мобильные диспергированные (рассеяные) гены).

 

В 40-х годах Барбара Мак-Клинток, американский генетик, обнаружила мозаичность  окраски зерен у кукурузы, небъяснимую  законами Менделя и мутационной теорией.

Она предположила, что некоторые  гены могут менять свое место в  геноме.

Определение: мобильные генетические элементы (МГЭ) - это последовательности нуклеотидов, меняющие свою локализацию и копийность в геноме.

 

Выделяют следущие классы МГЭ:

1. IS - вставочные элементы у прокариот.