Определение предмета молекулярная биология

2. Tn - транспозоны у прокариот. 

3. Эписомы у прокариот. 

4. Некоторые умеренные фаги.

5. Контролирующие элементы кукурузы.

6. Мобильные диспергированные гены  у дрозофилы, мыши, человека.

7. Провирусы.

В литературе "транспозоны" - все мобильные генетические элементы. Это элементы генома, которые меняют свое положение и копийность в  геноме.

 

IS-элементы 

Это самые простые транспозоны.

Размер IS-элементов ~1000 п.н. На концах они содержат инвертированные повторы (~20 п.н.). IS- элементы содержат только один ген - ген транспозазы, фермента, обеспечивающего перемещение IS-элемента по геному.

Транспозаза - это  обобщеный термин.

Разные транспозазы работают по-разному, но смысл общий:

транспозаза вырезает ДНК в одном месте и вставляет в другое место генома.

Перед геном в IS-элементе имеется  промотор, за геном - слабый терминатор транскрипции. Не всегда РНК-полимераза останавливается на нем, она может  продолжать транскрибировать и рядом  стоящий участок генома до сильного терминатора.

Tn-транспозоны 

Помимо гена транспозазы Tn-транспозоны  содержат один или несколько генов  лекарственной устойчивости. Копийность транспозона возрастает при наличии  провокационного фона (например, наличие  в среде антибиотика, ген устойчивости к которому кодируется в транспозоне).

Есть транспозоны, не содержащие гена транспозазы.

Такие транспозоны содержат по краям IS-элементы.

Размер транспозонов - 2.5-10 тыс. п. н.

Всем транспозонам свойственно  наличие прямых повторов, LTR (long terminal repeats - длинные концевые повторы)

После перехода из основной ДНК в  плазмиду транспозон может попасть  с ней в другую бактерию, придавая новому хозяину ранее отсутствующую  лекарственную устойчивость. Кроме  того, при вырезании транспозона  из геномной бактериальной ДНК захватываются участки генома одной бактерии, которые вместе с транспозоном переносятся в другую бактерию. Захват ДНК происходит, если эта ДНК находится между двумя транспозонами.

Умеренные фаги

-фаг может захватывать часть  генетической информации одной  бактерии и переносить ее в  другую. Поэтому сегодня говорят  о едином генофонде прокариот. 

 

 

 

Эффекты, вызываемые мобильными элементами

- Внедрение мобильных элементов  внутрь гена приводит к выключению  гена.

- Может нарушаться регуляция  гена, если мобильный элемент  внедряется между оператором  и цистроном (у мобильного элемента  есть свой промотор).

- Вставка мобильного элемента  может привести к экспрессии генов, которые не должны в данное время работать.

Наличие мобильных элементов является фактором, способствующим незаконной рекомбинации.

При незаконной рекомбинации перетасовываются гены, не имеющие отношения друг к другу.

Мобильные элементы провоцируют образование делеций, инверсий, дупликаций. Все это - хромосомные мутации.

 

Некоторые вирусы - на самом деле тоже мобильные элементы. В форме провируса они находятся в геноме клетки хозяина, а потом могут начать перемещаться. Это, например, онкорнавирусы, являющиеся ретровирусами.

 

Молекулярные  основы канцерогенеза

Признаки трансформированной клетки

1. Неконтролируемое деление. 

Искажен клеточный цикл. Продолжителен S-период. Стадия G2 сведена к минимуму.  Клетка вступает в митоз неготовой.

Последствия: нарушения при расхождении  хромосом.

Высокая потребность в энергии. При этом в элокачественных клетках  гликолиз (идущий без кислорода) превалирует  над окислительным фосфорилированием.

2. Клетки перестают  узнавать друг друга.

Происходит утрата контактного торможения. Это связано с изменением мембранных белков - белков-рецепторов и пр.

Нарушается адгезия (прилипание к  поверхности).

3. Раковые клетки дедифференцированы.

Теории  рака

До 70-х годов существовало три  теории рака:

1. Канцерогенная теория.

Известны професиональные раковые  заболевания: рак кожи у трубочистов, рак губы у кровельщиков и пр.

Бензпирен - первый описанный канцероген.

Определение: канцерогены - это вещества, повышающие частоту возникновения рака.

Но в экспериментах с канцерогенами не все животные заболевали.

2. Генетическая теория.

Появилась в 30-х годах. У лабораторных мышей известны высоко- и низкораковые лабораторные линии 

3. Вирусная теория.

В молоке мышей был найден "фактор молока" (вирус Битнера).

Объединение всех этих теорий произошло в 50-х годах. Отечественный ученый Лев Зильбер высказал гипотезу, что причиной рака может быть вирус, который становится геном. Обратная транскрипция

 

Определение: обратная транскрипция - это синтез ДНК по матрице РНК.

 

Обратную транскрипцию обнаружили в 1970 г. Темин, Балтимор, Дульбеко, работавшие с вирусом саркомы Рауса (ВСР). Этот вирус вызывает саркому у кур. Это онкорнавирус (oncoRNA) - относится к ретровирусам.

 

Определение: ретровирусы - это РНК-содержащие вирусы, в жизненный цикл которых входит стадия образования ДНК обратной транскриптазой и внедрение ее в геном клетки хозяина в форме провируса.

 

Предпочтительного места внедрения  провируса в геном нет. Это  позволяет отнести его к мобильным  генетическим элементам.

В состав ретровируса входит две  идентичные молекулы РНК. На 5'-конце  имеется Сap, на 3'-конце - поли А-хвост. Фермент обратную транскриптазу  вирус "носит" c собой.

Геном ретровируса  содержит 4 гена:

gag - белок нуклеоида,

pol - обратная транскриптаза,

env - белок капсида (оболочки),

onc - онкоген, ответственный за злокачественную трансформацию клетки.

str5 = str3 - (short terminal repeat) короткий концевой повтор;

U5, U3 - уникальные последовательности (U5 - 80 н., U3 - 200 н.);

PB (primer binding site) - участок связывания затравки.

 

На РВ садится (за счет комплементарности) tРНК и служит затравкой для  синтеза ДНК.

Синтезируется небольшой  кусок ДНК.

Обратная транскриптаза, обладая  еще и активностью РНК-азы Н, удаляет РНК в гибриде с  ДНК, а за счет идентичности str3 и str5 этот одноцепочечный участок ДНК взаимодействует с 3'-концом второй молекулы РНК, которая служит матрицей для продолжения синтеза цепи ДНК.

Затем РНК-матрица уничтожается и  по образовавшейся цепи ДНК строится комплементарная.

Образованная молекула ДНК длиннее  РНК. Она содержит LTR (U3 str 3(5) U5). В форме  провируса она находится в  геноме клетки хозяина. При митозе и  мейозе передается дочерним клеткам и потомкам.

 

Для экспрессии вирусных генов нужен толчок: канцерогены, изменения метаболизма в клетке хозяина, стресс.

Большинство изученных вирусных онкогенов  кодируют протеинкиназу, фермент, который  фосфорилирует белки. Как правило - это тирозиновая протеинкиназа. В клетке есть собственные протеинкиназы, в том числе и тирозиновая, но гораздо более активны сериновая и треониновая. Гены, кодирующие клеточные протеинкиназы, обозначают onc_c, вирусные - onc_v. Onc_c - клеточные гены, работающие в дифференцированных клетках. Onc_c имеют интроны, onc_v - не имеют. Onc_v либо добавляет тирозиновую протеинкиназу - и сказывается дозовый эффект гена тирозиновой протеинкиназы, либо, по сравнению с клеткой, не имеющей onc_v, клетка, его имеющая, фосфорилирует тирозин, а не серин или треонин, как обычно, то есть происходит смена мишени.

В первую очередь это касается белков, присутствующих в клетке в большом  количестве. Это белки цитоскелета (нарушение адгезии), мембранные белки (нарушение контактного торможения), гистоны (нарушение регуляции, компактизации, облегчение репликации ДНК).

Ретровирусы скорее всего возникли в результате внедрения мобильных  элементов в непосредственной близости от onc_c генов. В дальнейшем onc_c превратился в onc_v, а клеточная полимераза - в обратную транскриптазу. Вирус начал самостоятельную жизнь. Стадия провируса говорит о его клеточном происхождении.

В медицине рак - это злокачественная опухоль  только эпителиальных тканей.

Метастазы - возникающие  опухоли в районе удаления от исходной опухоли.

Рак - болезнь  генома.

Одним из путей активации onc_c является такая перестройка генома, в результате которой рядом с онкогеном появляется новый регуляторный элемент, обеспечивающий его более активную транскрипцию.

Другой путь - структурная мутация в протоонкогене, т.е. нормальном клеточном гене, способном превратиться в онкоген.

Существуют антионкогены, или гены-супрессоры опухолей, подавление активности которых  приводит к развитию опухолей.

Природа белковых продуктов онкогенов  и антионкогенов чрезвычайно разнообразна. К онкогенам относят некоторые гены белков - факторов роста, а также гены рецепторов факторов роста. Перепроизводство факторов роста или нарушение структуры их рецепторов может привести к более частому делению клеток. Изменения в генах, кодирующих белки - передатчики сигналов от рецепторов к ядру клетки, в основном, протеинкиназы различной специфичности, а также изменения экспрессии генов, ответственных за белковые факторы транскрипции, могут превратить нормальную клетку в раковую.

Подавление активности генов, ответственных  за рост и размножение клеток, осуществляется белковыми продуктами генов - супрессоров  опухолей. Так, ключевая роль в разрешении на переход из одной фазы клеточного цикла в другую принадлежит белкам - циклинам. Только находясь в комплексе с циклинами, циклинзависимые протеинкиназы способны фосфорилировать белки мишени, необходимые для перехода в следующую фазу клеточного цикла.

Специальные белки сканируют ДНК  перед репликацией на предмет  выявления нерепарированных повреждений. Если ДНК не проходит тест, то включаются системы реализации "запрограммированной смерти" - апоптоза, в результате чего разрушаются жизненно важные структуры клетки, в том числе хромосомы и цитоскелет. Апоптоз определяется большим числом генов, центральное место среди которых занимает ген, кодирующий белок с молекулярным весом 53 кДа, - ген p53. Этот ген поврежден в 50% всех опухолей человека. Когда он выведен из строя, клетки с поврежденной (мутантной) ДНК перестают выбраковываться и в них происходит накопление новых мутаций, которые могут затрагивать как протоонкогены, так и гены-супрессоры опухолей.

Как правило, рак развивается у  людей пожилого и старого возраста. Это связано с тем, что мутации  возникают случайно - и вероятность  накопления в клетке нужного для злокачественного превращения набора измененных генов увеличивается с годами. Посчитано, что в среднем в клетке человека должно накопиться 10 независимых мутаций, касающихся онкогенов и генов - супрессоров опухолей.

 

Гипотезы  возникновения жизни

Панспермия - жизнь витает в космосе и разносится по планетам. 
Жизнь зародилась абиогенно или нет?

Биогенез - живое только от живого.

Абиогенез - живое от неживого.

 

Луи Пастеру принадлежит первое прямое доказательство происхождения  живого только от живого. В 1862 году он получил премию Французской академии наук за эту работу.

Суть опыта: в колбе с изогнутой  трубкой находился прокипяченный  сенный настой. В течение нескольких недель он стоял совершенно прозрачный. Как только колбу наклонили (сквозь трубку в колбу попали микроорганизмы) - настой забродил.

Эксперимент правильный. Вывод - живое только от живого.

Авторитет Пастера был столь  велик, что к теории абиогенеза пришли лишь через 60 лет.

В 1924 году Александр Опарин высказал предположение, что ~4 млд. лет назад жизнь могла возникнуть абиогенно, в силу тех условий, которые существовали тогда на Земле.

Джон Холдейн рассчитал, какие  условия и как долго должны были существовать, чтобы зародилась жизнь, каковы необходимые источники  энергии для зарождения жизни.

Теория  биопоэза

Джон Бернал создал теорию биопоэза, включающую три стадии.

1. Образование биомономеров.

2. Образование биополимеров  и их эволюция. Образование систем  с обратной связью.

3. Образование мембранных  структур и пробионтов (первых клеток).

Экспериментальное доказательство первой стадии - опыты Стенли Миллера.

Суть опыта: в колбе находилась смесь газов (H₂, N₂, NH₃, CH₄, CO, CO₂) при температуре ~ 100 ⁰C. Кипящая вода служила источником водяного пара, а с помощью обратного холодильника поддерживалась циркуляция газовой смеси через сосуд. Давали искровой разряд в 60 тыс. вольт, что энергетически эквивалентно 50-и млн. лет на примитивной Земле. Результат был ошеломляющий: в колбе появились HCN, HCHO, HCOOH, несколько аминокислот, несколько азотистых оснований жирные кислоты, псирты, моносахара. Эксперимент повторяли много раз. Неперменное условие успеха - отсутствие в колбе свободного кислорода. В зависимости от pH раствора и соотношения газов были получены разные наборы соединений. Если была H₃PO₄, то образовывались даже нуклеотиды, а это уже гетерополимеры.

Таким образом была доказана первая стадия возникновения жизни. 4 млрд. лет тому назад с неизбежностью  должны были возникнуть биомономеры.

Первичная атмосфера образующейся Земли кислород содержала, но он весь пошел на окисление. Свободного кислорода не было. Таким образом, возникновение биомономеров и биополимеров происходило во вторичной бескилородной среде.

У стадии 3 в принципе есть доказательства. Самая сложная и неочевидная - стадия 2.

2 стадия  биопоэза.

Помимо 4-х основных классов биополимеров, могли образовываться и не дошедшие до нас гетерополимеры. Видимо, эволюция химических соединений шла по принципу минимума свободной энергии.