Отчет по практике в АО «Институт промышленной биотехнологии»

Однако большее предпочтение отдают бактериальным препаратам, т.к. они более жизнеспособны и конкурентоспособны в окружающей среде. На основе активных штаммов микроорганизмов – нефтедеструкторов   разработаны и созданы биопрепараты для ликвидации нефтезагрязнений окружающей среды, применяемые с различной степенью эффективности.

Использование биопрепаратов  гарантирует максимальную деструкцию нефтепродуктов; при этом ни в качестве промежуточных, ни в качестве конечных продуктов токсичные вещества не образуются.

Целый ряд современных биотехнологий предусматривает процесс микробной интродукции – внесение в природные среды (почву, грунты, водоемы) микроорганизмов с той или иной полезной функцией или биопрепаратов, разработанных на их основе.

Методы исследования: методы посева на твердые и жидкие питательные среды с инкубированием посевов в термостате и шейкере-инкубаторе; газохроматографический (ГЖХ) и гравиметрический методы количественного определения нефтяных углеводородов.

 

6.1. Изучение углеводородокисляющей активности штаммов – нефтедеструкторов, входящих в состав препарата «Экобак»

Углеводородокисляющую активность штаммов – нефтедеструкторов, входящих в состав препарата «Экобак» изучали на среде Ворошиловой – Диановой.  Препарат вносили в питательную среду Ворошиловой – Диановой,  содержащую 1% нефти, в трех параллелях. В контрольные колбы посевной материал не вносили. Колбы    инкубировали    на  качалке  с числом  оборотов     220 мин^-1 при температуре (29±1)°С.

Пробы культуральной жидкости (кж) на анализ отбирали на 5,6,7, 8, 9 сутки эксперимента

6.2. Определение численности углеводородокисляющих микроорганизмов

Численность углеводородокисляющих  микроорганизмов (УОМ) определяли на синтетической  среде Ворошиловой - Диановой следующего состава (г/л): NH₄NO₃ -1,5; KH₂PO₄ – 1,5;  K₂ HPO₄ – 1,5;  MgSO₄ – 0,4;  CaCl₂ – 0,03;  NaCl – 15,0; FeCl₂ – 2 капли насыщенного раствора; нефть– 1%;  агар-агар – 20,0; вода дистиллированная до 1 литра. Среду стерилизовали при температуре (121±1)^оС в течение 30 мин. Нефть стерилизовали отдельно при температуре   (110±1)°С  в течение 30 мин. рН среды после стерилизации – 6,9.

Посевы культивировали в чашках Петри в термостате при температуре (29±1) ^оС в течение 4-5 суток.

6.3. Экстракция нефтяных углеводородов из культуральной жидкости и концентрирование

Содержание нефтяных углеводородов  в кж определяли методом  извлечения нефтепродуктов из анализируемых  проб органическим растворителем  в  делительной воронке из одной  жидкой фазы в другую, с последующим  разделением экстракта на алифатичекую  и ароматическую фракции колоночной хроматографией на силикагеле и количественном определении нефтяных углеводородов газохроматографическим и гравиметрическим методами.

Пробу культуральной  жидкости трижды экстрагировали метилен  хлоридом по 10 мл в стеклянной делительной воронке вместимостью 125 мл в течение  5 мин при периодическом встряхивании содержимого воронки.

После расслаивания жидкостей  слой метилен хлорида, содержащий извлеченные  нефтяные углеводороды, отделяли от водного  слоя. Объединенную органическую фазу сушили путем фильтрования через воронку безводным сульфатам натрия, и затем упаривали в вытяжном шкафу на водяной бане.  Остаток растворяли в 35 мл гексана и продолжали упаривание до 5 мл экстракта до полной замены метилен хлорида на гексан. Затем объем экстракта доводили до 35 мл гексаном.

6.4. Очистка экстрактов

Очистку экстрактов проб от полярных соединений проводили последовательно  на упакованных колонках с силикагелем. Колонку, упакованную силикагелем,  последовательно промывали 30 мл метилен  хлорида 60 мл гексана, после чего в колонку вносили 1 мл очищаемого экстракта.  Элюировали 19 мл гексана, собирая алифатическую фракцию углеводородов.  Затем  элюировали  ароматическую фракцию 20 мл метилен хлорида.  Полученные фракции  концентрировали  до 1 мл.  Сконцентрированные экстракты  алифатической и ароматической фракций анализировали методом ГЖХ.

6.5. Анализ экстрактов

6.5.1. ГЖХ анализ

Аликвотную часть сконцентрированного  экстракта алифатической и ароматической  фракций (5 мкл) вводили микрошприцом  в нагретый до 300°С  испаритель газового хроматографа с пламенно-индукционным детектором.  Разделение углеводородов осуществляли на капиллярной колонке DB-608, 30м´0,53мм, 14% цианопропил фенил силикон, с толщиной пленки 0,83 mкм (J&W Scientific). Температура колонки программировалось от  40 до 300° С (скорость подъема температуры 10°С/мин). Температура ПИД 340 °С. Расход газа-носителя (водород) 10 мл/мин.

6.5.2. Гравиметрический анализ

Сконцентрированный экстракт переносили во флакон, предварительно взвешенный. Растворитель испаряли  при комнатной температуре. После полного удаления растворителя флакон взвешивали, выдерживали в течение часа в лаборатории для полного испарения растворителя. Повторно взвешивали и при совпадении массы анализ заканчивали.

По разности массы с содержимым и без содержимого определяли массу обнаруженных углеводородов. Результаты анализов представлены  в таблице 1.

 

Таблица 1 - Определение содержания нефтяных углеводородов в культуральной жидкости с 1% содержанием нефти

№  лабораторной пробы	Определяемый элемент (аналит.) мг/кг
	Углеводороды нефтяного  ряда
	Алифатическая фракция	Ароматическая фракция	Общая фракция углеводородов  нефтяного ряда	ГЖХ/ПИД анализ
К	10,00	960,00	970,00	930,9
1/Э	7,00	742,00	749,00	734,0
2/Э	18,00	684,00	702,00	692,7
3/Э	18,00	756,00	774,00	769,7

 

6.6.Результаты исследований

В ходе эксперимента изучена динамика роста углеводородокисляющих штаммов, входящих в состав препарата «Экобак» при культивировании на среде с нефтью (табл. 2)

 

Таблица 2 – Изменение численности углеводородокисляющих микроорганизмов в динамике

Показатель	Время роста
	Исх.титр	5 сут.	6 сут.	7 сут.	8 сут.	9 сут.
Титр, КОЕ/мл	1,7∙107	0,8∙107	9,6∙107	2,4∙108	3,21∙109	2,0∙107

Наиболее высокий титр клеток наблюдали на 8 сутки эксперимента.

Эффективность воздействия биопрепаратов рассчитывали по отношению разрушенных (усвоенных) микроорганизмами нефтеуглеводородов к исходному их содержанию в образцах за время t, выраженному в процентах:

Эфф=((С₀ - С_t)/C₀) x100,

где: С₀ - исходное содержание нефтепродуктов в КЖ;

С_t - содержание нефтепродуктов в отборах образцов КЖ в динамике.

В таблице 3 представлены данные по деструкции нефтяных углеводородов  штаммами микроорганизмов, входящих в  состав препарата «Экобак».

Таблица 3 – Эффективность разрушения нефтеуглеводородов препаратом «Экобак»

Методы анализа	Начальное содержание нефти, мг/кг	Конечное содержание нефти, мг/кг	Деструкция, %
ГЖХ	930,9	732,1	21,4%
Гравиметрический	970,0	941,7	23,5%

 

 

6.7.Выводы

Деструкция углеводородов  нефти при использовании препарата «Экобак» за 9 суток составила 21-23%.

В контроле (среда Ворошиловой  – Диановой без внесения препарата) деструкция углеводородов нефти  не наблюдалась. 

Таким образом,   биологический  препарат «Экобак» может быть использован  для очистки среды (почва, вода) от нефтяных загрязнений.

 

7.Экономическая  эффективность

Расчеты затрат на исследования способности биопрепарата «Экобак» к биодеградации нефтяных углеводородов и возможности использования его в качестве деструктора нефтяных загрязнений представлены в таблице 1 и 2.

 

 

 

 

 

 

Таблица 1- Расчет стоимости сырья,  материалов, химреактивов

№	Наименование	Ед.изме-рения	Кол-во	Цена, тг	Стоимость, тг
1	Спирт этиловый	л	0,2	630	126
2	Кальций хлористый	кг	0,0001	1061	0,1
3	Агар	кг	0,08	17410	1393
4	Аммоний  азотнокислый	кг	0,0045	1637	7,4
5	Калий фосфорнокислый двузамещенный	кг	0,0045	1427	6,4
6	Калий фосфорнокислый однозамещенный	кг	0,0045	1680	7,5
7	Магний сернокислый	кг	0,0008	234	0,2
8	Натрий хлористый	кг	0,045	383	17
9	Хлорид железа	л	0,008	1062	8
10	Колбы качалочные  0,75 л	шт	5	1500	6500
11	Груша, мед	шт	1	180	180
12	Вата медицинская	кг	0,1	500	50
13	Моющие средства	-	-	-	500
14	Чашки Петри	шт	52	90	4680
15	Спиртовка	шт	1	605	605
16	Пипетки	шт	100	5	500
17	Перекись водорода	л	0,3	1400	420
	Итого				8988

Таблица 2 - Расчет стоимости электроэнергии

№	Наименование  оборудования	Ед.изме-рения	Паспорт. мощность	Время работы, ч	Стоимость, тг
1	Термостат	кВт/час	0,5	72	218,88
2	Автоклав	кВт/час	6	4	145,92
3	Весы лабораторные	кВт/час	0,05	1	0,304
4	Электроплита	кВт/час	1	2	12,16
5	РН-метр "150 М"	кВт/час	0,3	8	14,592
6	Встряхиватель	кВт/час	1	48	291,84
7	Счетчик колоний	кВт/час	0,3	1	1,824
8	Шейкер	кВт/час	1	2	12,16
	Итого				697,68

 По таблицам видно,  что в общем на исследование  моей работы было затрачено  9685,68 тенге.

 

8.  Проведение ПЦР – анализа

В целях ознакомления с общими диагностическими методами я наблюдала за проведением ПЦР-анализа для диагностики венерических заболеваний.

Меры предосторожности:

1. Работать только в одноразовых перчатках, использовать и менять при каждой операции одноразовые наконечники для электронных или механических дозаторов с аэрозольным барьером. Одноразовая пластиковая посуда (пробирки, наконечники) должна сбрасываться в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующий 0,2 % раствор ДП-2Т или др.
2. Анализ проводится в три этапа в трех отдельных помещениях (зонах), согласно МУ 1.3.1888-04 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III – IV групп патогенности».
3. Все лабораторное оборудование, в том числе дозаторы, штативы, лабораторная посуда, а также все рабочие растворы должны быть строго стационарными. Запрещается их перенос из одного помещения в другое. Персонал, работающий в помещении для детекции продуктов ПЦР-амплификации (зона 3), не должен посещать помещения для обработки исследуемого материала (зона 1) и проведения реакции ПЦР-амплификации (зона 2). Смена верхней одежды, головных уборов, обуви, перчаток является обязательным условием при выходе из помещения для электрофоретического анализа.
4. Поверхности столов, а также помещения, в которых проводится постановка ПЦР-амплификации, должны быть обязательно до начала и после окончания работ облучаться ультрафиолетовым светом в течение 30 мин.
5. При работе с включенным трансиллюминатором необходимо пользоваться защитным экраном или специальной защитной маской, так как ультрафиолетовый свет вызывает ожоги лица и слизистой глаз.