Отчет по практике в АО «Институт промышленной биотехнологии»

Взятие клинического материала, хранение и транспортирование  проб

Процедура взятия клинического материала описана в методических рекомендациях «Взятие, транспортирование и хранение клинического материала для ПЦР-диагностики».

Для исследования используется следующий клинический материал: соскобы и мазки со слизистых  оболочек урогенитального тракта, содержимое папул, везикул, эрозивно-язвенных элементов, осадок клеток первой утренней мочи, секрет предстательной железы. Материалом может служить цельная кровь и ликвор.

Условия хранения проб:

- при комнатной температуре  – в течение 6 ч;

- при температуре от 2 до 8 С – в течение 1 нед;

- при температуре не  выше минус 16 С – в течение 1 мес;

- при температуре не  выше минус 68 С – в течение  2 мес.

ПЦР-диагностика состоит  из 3 этапов: выделение ДНК из проб, проведение ПЦР-амплификации, детекция продуктов ПЦР-амплификации методом  электрофореза в агарозном геле.

Этап 1 (проводится в зоне 1 – помещении для обработки проб)

Объем пробы, необходимый  для выделения ДНК – 0,1мл.

Порядок работы:

1. Лизирующий раствор прогреть, перемешивая при температуре 65 С до полного растворения кристаллов.
2. Добавление реагентов.
3. В пробирки согласно маркировке внести по 100 мкл пробы. В пробирку отрицательного контроля выделения внести 100 мкл ОКО.
4. Содержимое пробирок тщательно перемешать на вортексе и инкубировать 5 мин при температуре 65 С в термостате. После окончания инкубации перемешать на вортексе и поставить в штатив на 2 мин.
5. Осадить сорбент универсальный в пробирках центрифугированием при 10 тыс об/мин в течение 30 с. Не захватывая сорбент, удалить надосадочную жидкость.
6. Добавить в пробы по 1 мл отмывочного раствора, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента. Повторить п.5.
7. Поместить пробирки в термостат с Т=65 С на 5-10 мин для подсушивании сорбента. При этом крышки пробирок должны быть открыты.
8. В пробирки добавить по 100 мклТЕ-буфера для элюции ДНК. Перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента. Поместить в термостат с Т=65 С на 5 мин.
9. Перемешать на вортексе. Центрифугировать пробирки при 12 тыс об/мин в течение 1 мин на микроцентрефуге. Надосадочная жидкость содержит чистую ДНК.

Этап 2 (проводится в зоне 2 – помещении для проведения ПЦР-амплификации)

Общий объем реакции  – 25 мкл, объем ДНК-пробы – 10 мкл.

1. Подготовка пробирок для проведения ПЦР.
2. Проведение амплификации:

а) под масло или  непосредственно на масло внести по 10 мкл ДНК-проб, выделенных из исследуемых или контрольных проб этапа выделения ДНК.

б)  поставить контрольные  реакции амплификации:

- отрицательный контроль (К-) – вместо ДНК-пробы внести  в пробирку 10 мкл  ДНК-буфера;

- положительный контроль (К+) – внести в пробирку 10 мкл  ПКО ДНК.

3. Запустить в амплификаторе программу. Время амплификации на амплификаторе с регулированием температур по матрице примерно 2 ч 30 мин, на амплификаторе с активным регулированием – 1 ч 50 мин.
4. После окончания реакции собрать пробирки в штатив и отправить в помещение для детекции продуктов ПЦР-амплификации (зону 3).

Этап 3 (проводится в зоне 3 – помещении для детекции продуктов ПЦР-   амплификации).

1. Приготовление рабочих растворов и агарозного геля.
2. Пробирки с продуктами амплификации выставить в штатив последовательно, отобрать из-под слоя масла по 10-15 мкл пробы и внести в лунки геля. В каждом ряду лунок должен быть представлен К+ и маркер молекулярных масс.
3. Подключить камеру  к источнику тока и включить источник. Параметры источника следующие: напряжение 250 В, стабилизация по напряжению, время электрофореза – 18-20 мин.
4. Когда краситель пройдет примерно половину длины геля, выключить источник тока, перенести гель на трансиллюминатор, расположив полосы горизонтально лунками вверх. Получить изображение геля на компьютере с помощью видеосистемы, отмечая порядок нанесения проб, занести в базу данных.

   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для прохождения профессиональной (производственной) практики я была направлена в лабораторию мониторинга в группу микробиологического анализа, где была ознакомлена с техникой безопасности, с оборудованием, с составами и особенностями приготовления питательных сред, а также с одним из важнейших и необходимых приемов микробиологической практики – стерилизацией. С первого же дня своего пребывания в лаборатории я ознакомилась с его структурой, основными видами деятельности и научно-исследовательскими работами, проводимыми в ее отделах.

В группе микробиологического  анализа при работе на участке  приготовления и стерилизации питательных  сред я изучила составы питательных сред, наиболее часто используемых в лаборатории, а также с их свойствами и главное, с методикой приготовления. Мною были приготовлены питательные среды: синтетическая ПС Ворошилова-Дианова, МПА, ФРЖ, среда Чапика для грибов и т.д.

Научилась правильно монтировать лабораторную посуду, подготавливать её к стерилизации, изготавливать ватно-марлевые пробки для посуды различного диаметра. Ознакомилась со строением и принципами работы аппаратов для стерилизации – сухожаровым шкафом и автоклавом. Закрепила практические навыки по использованию и обслуживанию аппаратов и оборудования биотехнологии.

Работала в  боксе. При работе в боксе научилась  работать с ножной грушей, спиртовкой. Училась разливать агаризованные  питательные среды в чашки  Петри, рассевать культуру микроорганизмов на поверхность плотной среды шпателем в асептических условиях. Научилась определять количество клеток микроорганизмов высевом на плотные питательные среды (приготовление разведений, посев, подсчет выросших колоний). Приобрела навыки работы с аппаратом для подсчета колоний.

С первых же дней моего пребывания на практике, приобрела  навыки работы с рН-метром, при помощи калибровочных растворов, научилась  калибровать сам прибор. Научилась  работать с электрическим шейкером при приготовлении разведений для получения изолированных колоний.

Научилась методам: выделение  чистых культур микроорганизмо, приготовление  серийных разведений, определение  титра культур, подсчет колоний.

Также, в связи  с тем, что здесь находится  хорошая библиотека, я получила теоретические знания не только по своей теме по практике, но и по другим направлениям биотехнологии.

При постановке ПЦР-анализа наблюдала выделение  ДНК. Ознакомилась с мерами предосторожности при работе в ПЦР-лаборатории  и основными этапами ПЦР-диагностики.

По окончании практики, я сделала вывод о том, что  при работе в лаборатории обязательно  нужно соблюдать правила техники  безопасности, соблюдать все инструкции при работе с микроорганизмами и  обладать следующими качествами:

• Ответственностью
• Аккуратностью
• Исполнительностью
• Живостью ума
• Внимательностью
• Умением работать с литературой.

За время  производственной практики в ТОО  «НАЦ «Биомедпрепарат» я получила бесценный  опыт практической работы в лаборатории  микробиологии, приобрела навыки и  умения по своей профессии. После производственной практики у меня появился еще больший интерес к моей специальности – биотехнология, и я, надеюсь, что в будущем я буду работать в этом направлении.

Я выражаю огромную благодарность сотрудникам лаборатории мониторинга, которые создали для меня необходимые условия для прохождения производственной практики. Особенно выражаю искреннюю благодарность руководителю практики – научному сотруднику Парамоновой Ирине Евгеньевне за полученные мною знания, умения и навыки практической работы.

 Благодаря  высококвалифицированным специалистам  лаборатории, я закрепила теоретические знания, полученные в университете, приобрела необходимые умения и навыки в области микробиологии и биотехнологии. Тот бесценный опыт, который я приобрела в лаборатории микробиологии, я обязана научным сотрудникам НАЦ «Биомедпрепарат».

 

 

 

.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

 

1.Булатов А.И., Макаренко  П.П. Охрана окружающей среды в нефтегазовой промышленности.  Изд-во: Недра.1997.

2.Орлов Д.Г., Малинина  М.С., Мотузова Г.В. Химическое загрязнение почв и их охрана. М: Агропромиздат. 1991.

3.Оборин А.А., Калачникова  И.Г., Масливец Т.А., Базенкова И.И., Плещеева О.В., Оглоблина А.И. Восстановление  нефтезагрязненных почвенных экосистем.  М: Наука.- 1988.

4.Ившина И.Б. Лекарства для экосистем // Наука Урала. - 2009. - №12.

5.Конурбаева М.У., Доолоткельдиева  Т.Д. Изучение способности штаммов  Pseudomonas в биодеградации нефтепродуктов. Бишкек. -2008.

6.Коронелли Т.В., Комарова  Т.И., Ильинский В.В., Кузьмин Ю.И.  Прикладная биохимия и микробиология. 1997.-Т.33. -№2.

7.Квасников Е.И., Клюшникова  Т.М. Микроорганизмы - деструкторы  нефти в водных бассейнах. К.: Наукова думка. -1981.

8.Дермичева С.Г., Шигаева  М.Х. Углеводородокисляющие микроорганизмы. Алматы.- 1994.

9.Миронов О.Г. Нефтеокисляющие микроорганизмы в море. К.: Наукова думка.- 1971.

10.Смирнов В.В., Киприанова  Е.А. Бактерии рода Pseudomonas. Киев: Наукова  думка. -1990.

11.Маркова, М. Ю., Емельянова  Л. Г., Щемелинина Т. Н. Новые  технологии для очистки нефтезагрязненных вод, почв, переработки и утилизации нефтепродуктов. М.: Химия. -2001.

12.Холоденко В.П., Чугунов В.А., Жиглецова С.К., Родин В.Б., Ермоленко З.М.,  Фомченков В. М., Ирхина И.А., Кобелев В.С., Волков В.Я. Разработка биотехнологических методов ликвидации нефтяных загрязнений окружающей среды // Журнал Российского химического общества им. Д. И. Менделеева. 2001. Т. XLV.

13. Нечаева И.А. Биодеградация углеводородов нефти психротрофными микроорганизмами-деструкторами // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.  Пущино – 2009.

14.ЛМО/СОП-16. Анализ органических соединений методом ГЖХ/ПИД.

15.Рогозина Е.А., Калимуллина Г.М.  Балансовая сторона утилизации  нефтяного загрязнения почвы  биопрепаратами серии «Нафтокс». //Нефтегазовая геология. Теория и практика. - 2007 (2).

16.Мосунова Ю. В. Биоремедиация почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, в условиях Западного Предкавказья // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук. Краснодар – 2009.