Сателитная ДНК

ОГЛАВЛЕНИЕ

	Стр.
Перечень условных обозначений	4
Введение	5
Глава 1. ОБЩЕЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ  САТЕЛЛИТНОЙ ДНК	6
Глава 2. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ  САТЕЛЛИТНЫХ ДНК	7
2.1. МЕТОД ЭНДОНУКЛЕАЗНОЙ  РЕСТРИКЦИИ	7
2.2. МЕТОД «ОСТАТОЧНОЙ»  ДНК	7
2.3. СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ПРАЙМЕРЫ	7
2.4. ГЕНОМНАЯ САМОАМПЛИФИКАЦИЯ («selffpriming»)	8
2.5. ГИБРИДИЗАЦИЯ КЛОНИРОВАННЫХ  ФРАГМЕНТОВ	8
Глава 3. САТЕЛЛИТНЫЕ ДНК  ЖИВОТНЫХ	9
Глава 4. САТЕЛЛИТНЫЕ ДНК  РАСТЕНИЙ	11
Глава 5. МЕТИЛИРОВАНИЕ САТЕЛЛИТНЫХ  ДНК	14
5.1. ФЕРМЕНТЫ, УЧАСТВУЮЩИЕ  В МЕТИЛИРОВАНИИ	14
5.2. КЛЕТОЧНЫЕ ФУНКЦИИ  МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК	15
Глава 6. ИЗГИБЫ В САТЕЛЛИТНЫХ  ДНК	18
6.1. КОМПЬЮТЕРНЫЙ АНАЛИЗ  САТЕЛЛИТНЫХ ДНК CITRUSИPONCIRUS	18
6.2. ИЗГИБЫ ДНК И ЭВОЛЮЦИЯ  ПОВТОРОВ	21
Глава 7. ЦЕНТРОМЕРЫ И САТЕЛЛИТНЫЕ  ДНК	23
7.1. СТРУКТУРНАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ  ЦЕНТРОМЕР	23
7.2. КОМПОНЕНТЫ ДНК ЦЕНТРОМЕР  РАСТЕНИЙ	26
7.3. ЭВОЛЮЦИЯ ЦЕНТРОМЕР  РАСТЕНИЙ	27
7.4. ЦЕНТРОМЕРНЫЙ ГЕТЕРОХРОМАТИН  И КИНЕТОХОР	28
7.5. БАЗОВАЯ МОДЕЛЬ РЕГИОНАЛЬНОЙ ЦЕНТРОМЕРЫ	31
Заключение	33
Список использованных источников	34

 

                                                                                                                                             

 

 

 

 

 

 

 

 

Список условных сокращений и определений

 

 

англ. Long interspersed nuclear repeats                                                                LINE 

 

центромер-специфический гистон                                                                     CENP                                    

 

англ. miniature inverted-repeat transposable elements                                         MITE

 

пары нуклеотидов                                                                                                    п.н.

 

Англ. Fluorescent in situ hybridization

(флюоресцентная гибридизация in situ)                                                            FISH

 

англ.Short interspersed nuclear repeats                                                                SINE 

 

англ.Long terminal repeat                                                                                        LTR

 

Англ.Contour-clamped Homogeneous Electric Field                                           CHEF

 

 

 

 

 

 

 

ВВЕДЕНИЕ

Важным атрибутом корректной во времени и пространстве экспрессии генов и, соответственно, функционирования эукариотической клетки является высокоорганизованное и детерминированное расположение ДНК в клеточном ядре. Накапливается все больше данных относительно структурной организации хромосом не только митотических и мейотических клеток, но также и в интерфазной стадии. Цитологические исследования с применением улучшенной флуоресцентной in situ гибридизационной техники (FISH) позволили довольно детально изучить высокоорганизованную структуру хромосом в интерфазном ядре. Общеизвестно, что количество ДНК в гаплоидном наборе хромосом эукариот значительно превышает количество ДНК, содержащееся в структурных и регуляторных генах. К настоящему времени охарактеризованы хромосомоспецифиические многократно повторяющиеся тандемно организованные сателлитные ДНК многих эукариот. Исследования при помощи FISHтехники помогли точно идентифицировать их локализацию в хромосомах.

 Способность поддерживать  индивидуальную структуру хромосом  и регулировать размер генома является интересным свойством этих последовательностей. Многократно повтооряющаяся сателлитная ДНК участвует в формировании центромер-специализированного хромосомного участка, который необходим для точного распределения гомологичных хромосом в митозе и мейозе. Долгое время, главным образом на основе исследований αсателлитной ДНК человека и центромерной ДНК дрожжей, считалось, что в центромерном регионе присутствуют только сателлитные ДНК. Однако, недавно проведенные исследования животных и растительных клеток показали, что центромеры формируются различными повторяющимися компонентами ДНК, в числе которых нередко обнаруживаются и ретротранспозоноподобные элементы. Концы индивидуальных хромосомных ДНК, рассеянные в интерфазном ядре и сконденсированные в метафазных стадиях, сформированы главным образом теломерной ДНК, состоящей из коротких,  законсервированных и многократно повторяющихся мотивов из6–7 п.н. [9].

Ввиду того, что теломеры неспособны полностью реплицироваться  обычным способом, с помощью ДНК-полимеразы, для поддержания длины хромосомы необходим специфический фермент теломераза. Присутствие теломеразы и ее регуляция в специфических типах клеток, как и потеря теломерной ДНК в стареющих клетках, становится в настоящее время одной из интересных проблем при исследовании растений. Таким образом концы, центральная часть и другие области хромосомной ДНК заполнены повторяющимися элементами ДНК, которые консервативны в теломерах, но весьма вариабельны в центромерах, субтеломерных и других областях хромосом. В данной работе рассматриваются, в основном, вопросы организации, эволюции и функциональных особенностей многократно повторяющихся сателлитных ДНК.

 

 

ГЛАВА 1

ОБЩЕЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ  САТЕЛЛИТНОЙ ДНК

 

Сателлитные ДНК являются характерным компонентом генома всех эукариот. Сначала этим термином обозначали ту часть генома, которая отделялась при градиентном ультрацентрифугировании и, следовательно, по плотности и по содержанию AT/GC должна была отличаться от основной массы ДНК. Следует отметить, что этот термин является техническим обозначением физико-химических свойств означенных фракций, а не отражением их биологических свойств. В дальнейшем выяснилось, что гены рибосомной РНК (рДНК), митохондриальные и хлоропластные ДНК могут образовывать отдельные сателлитоподобные пики в градиенте; с другой стороны, «истинные» сателлиты с GC-составом, идентичным с основной ДНК, невозможно отделить от основной массы ДНК и они обнаруживаются как «скрытые» сателлиты. С течением времени, по мере совершенствования методов исследования, определение сателлитной ДНК претерпело изменения. В настоящее время под этим термином подразумевается характерный компонент эукариотического генома, состоящий из тандемно организованных повторов; сателлитная ДНК не кодирует белки и локализована в конститутивном гетерохроматине хромосом. При этом в родственных геномах часто обнаруживается наличие общих или родственных типов сателлитных ДНК [6].

Типичные сателлиты с  характерным сайтом для одной (или  многих) эндонуклеаз рестрикции были названы «рестрикционными сателлитными ДНК». Следует четко разграничить термины сателлитные ДНК и мини и микросателлитные ДНК. Основное различие между ними заключается в следующем:

1. Мини и микросателлиты в отличие от сателлитных ДНК обнаруживаются в эухроматине.

2. Число копий повторов  в мини и микросателлитах намного меньше по сравнению с сателлитными ДНК.

Общим для всех трех компонентов  является наличие тандемно расположенных повторов, а префиксы мини и микро отражают различия в длине повторяющихся единиц. Длина повторяющейся единицы минисателлитных ДНК составляет 10–100 п.н., а микросателлитных – менее 10 п.н. Длина повторов сателлитных ДНК не имеет каких либо ограничений. Она варьирует от 2 п.н. до нескольких сотен. Повторяющиеся единицы сателлитных ДНК различны по своей специфичности. Некоторые повторы встречаются в большом количестве во всех видах определенного рода, в то время как другие могут присутствовать в одном или нескольких видах. Обнаружены существенные отличия в степени амплификации повторов между дикими видами и культурными видами высших растений. Выявлена дивергенция последовательности повторяющихся единиц сателлитных ДНК порядка 5–15% даже у отдельных индивидумов в пределах вида [5].

 

 

Глава 2

 МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ  САТЕЛЛИТНЫХ ДНК

 

Сателлитные ДНК обнаруживаются в виде тандемно расположенных многократно повторяющихся последовательностей в гетерохроматиновых областях эукариотических хромосом. Новая номенклатура использует термин «рестрикционные сателлиты», поскольку тандемно организованные относительно гомогенные повторы могут быть расщеплены специфическими эндонуклеазами рестрикции. После блоттинга по Саузерну и гибридизации с меченой тотальной ДНК (или клонированного повтора) лестничноподобная картина гибридизации доказывает наличие сателлитной ДНК. Этим методом удается обнаружить также «скрытые» сателлиты, которые не разделяются в градиенте плотности CsСl. Ниже приводится краткий перечень новых методов, которые наряду с традиционным методом градиентного ультрацентрифугирования применяются для выделения сателлитных ДНК [10].

 

2.1 МЕТОД ЭНДОНУКЛЕАЗНОЙ РЕСТРИКЦИИ

Тотальная ДНК расщепляется разными, преимущественно 4 п.н. расщепляющими эндонуклеазами рестрикции (например, НаeIII, TagI, Sau3a и др.), переносится по Саузерну и гибридизуется с тотальной ДНК. Мономерные полосы можно вырезать из геля, клонировать и использовать для следующей гибридизации по Саузерну. Обнаружение лестничноподобных рестрикционных фрагментов при гель-электрофорезе свидетельствует о наличии сателлитной ДНК. При использовании данного метода следует с осторожностью подойти к расщеплению Sau3a или BamHI, так как можно получить лестничную структуру не сателлитной, а 5S рДНК (в кодирующем участке 5S рДНК содержится косервативный BamHI /Sau3a рестрикционный сайт).

 

2.2 МЕТОД «ОСТАТОЧНОЙ» ДНК

Тотальную ДНК расщепляют рестрикционными ферментами, которые  не расщепляют сателлитные последовательности и разделяют на агарозном геле. Высокомолекулярную нерасщепленную остаточную ДНК вырезают из геля и для ее расщепления подбираются специфические  эндонуклеазы рестрикции. Полученные фрагменты клонируют. Сателлитсодержащие клоны детектируют при помощи меченой «остаточной» ДНК.

 

2.3. СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ПРАЙМЕРЫ

Если сателлитные ДНК  определенного вида уже охарактеризованы, строится праймер для ее повторяющейся единицы и с его помощью проводится амплификация сателлитной ДНК родственных видов.

 

 

2.4. ГЕНОМНАЯ САМОАМПЛИФИКАЦИЯ («selffpriming»)

Многократно повторяющуюся  ДНК можно амплифицировать и  без праймеров, если тотальную ДНК фрагментировать ультразвуком или расщепить 4 п.н. расщепляющими рестрикционными ферментами. На первом этапе тотальная ДНК служит матрицей, а фрагментированная ДНК является праймером. Во втором раунде первый продукт ПЦР используется как «новая матрица». При помощи этого метода происходит существенное обогащение сателлитных ДНК.

2.5. ГИБРИДИЗАЦИЯ КЛОНИРОВАННЫХ ФРАГМЕНТОВ

Тотальная ДНК расщепляется при помощи эндонуклеаз рестрикции, клонируется в E. coli, а полученные колонии гибридизуются с тотальной меченой ДНК. Клоны, содержащие повторяющуюся ДНК, дают сильный гибридизационный сигнал и в дальнейшем их можно охарактеризовать с помощью секвенирования [16].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Глава 3

САТЕЛЛИТНЫЕ ДНК  ЖИВОТНЫХ

 

Сателлитным ДНК животных посвящено большое количество публикаций. Ниже приводятся данные, которые позволяют сформулировать общие представления об их происхождении и эволюции. Общепринято, что сателлитные ДНК эволюционировали по схеме «согласованной эволюции». Считается, что главными рекомбинационными механизмами, образующими и поддерживающими внутривидовую гомогенность сателлитных ДНК, являются неравный кроссинговер, конверсия генов, репликационное скольжение и обмен сестринскими хроматидами. Ввиду отсутствия модельных систем, которые позволили бы детально исследовать эволюционную динамику сателлитных ДНК in vivo, наши знания опираются на данные сравнительного анализа сателлитных ДНК близкородственных видов и компьютерное моделирование [11].

Наличие большого количества видоспецифичных семейств сателлитных  ДНК свидетельствует об их быстрых  превращениях и характеризует их как нестабильные компоненты генома. В то же время, описаны случаи и относительно медленной эволюции семейств сателлитных ДНК. В качестве примера можно привести сателлитную ДНК pvB370, характерную для разных видов группы Drosophila virilis. Различия в консенсусной последовательности pvB370 у этих видов не наблюдаются. Если суммировать имеющиеся данные, можно обнаружить корреляцию между гомогенностью повторяющейся единицы, числом копий и обменом сателлитных ДНК, т.е. сателлитные ДНК с малым числом копий являются очень гомогенными и эволюционируют медленно. Семейства сателлитных ДНК с большим числом копий являются более гетерогенными и нестабильными. Эту корреляцию хорошо иллюстрируют три семейства сателлитных ДНК сверчка Dolichopoda schiavazzii. Изучение сателлитных ДНК некоторых насекомых показывает, что мейотическая рекомбинация является главным механизмом их эволюции. При сравнении бисексуальных и партеногенетически репродуцируемых видов, встречающихся в Сицилии, становится очевидным, что эволюционные превращения сателлитных ДНК являются более быстрыми у сексуально репродуцируемых видов по сравнению с партеногенетическими. В специфических случаях, когда определение морфологических различий затруднено или почти невозможно, видоспецифические сателлитные ДНК позволяют быстро и достоверно идентифицировать тот или иной организм. Это можно проиллюстрировать на двух примерах. Две специфические сателлитные ДНК дают возможность различить бисексуальные и партеногенетические штаммы морских креветок Artemia. С помощью сателлитной ДНК удалось четко идентифицировать личинки Onchocerca volvulus. Сателлитные ДНК были также использованы для выяснения филогенетических отношений близкородственных видов Drosophila. Однако после разработки метода ПЦР для тех же целей можно использовать другие молекулярные маркеры, такие как например митохондриальная ДНК, требующие меньших технических усилий [1].