Сателитная ДНК

Таким образом, можно предположить, что метилирование сателлитных  последовательностей может выполнять различные функции – понижать транскрипционный «шум», инактивировать транспозоны и стабилизировать тандемно расположенные единицы в клеточном ядре. Несмотря на значительные достижения в понимании метилирования цитозина, все еще остается много вопросов. (I) Необходимо ли метилирование для сателлитов? Известно, что сателлиты одноклеточных дрожжей и Drosophila выполняют свои функции без модификации цитозина. (II) Каким образом некоторые сателлитные единицы не метилируются, тогда как другие гиперметилированы? (III) Как «машина» метилирования узнает повторы? Определяется это структурными свойствами ДНК, например изгибами, факторами хроматина и/или же другими эпигенетическими модификациями, например метилированием, ацетилированием, и/или фосфорилированием гистонов? (IV) Влияет ли метилирование на мутабельностьи эволюцию сателлитов?

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Глава 6

ИЗГИБЫ В САТЕЛЛИТНЫХ  ДНК

 

Изгибы в ДНК могут играть существенную роль в образовании конститутивного гетерохроматина в клеточном ядре. Изогнутость в ДНК часто коррелирует с присутствием множественных адениновых блоков как в синтетических, так и в природных молекулах ДНК. Известно, что если в молекуле ДНК адениновые блоки повторяются в фазе с шагом спирали, общий изгиб достигает значительной величины и статический изгиб можно детектировать физическими методами. В эукариотах, включая дрожжи, животных и растения, повторы сателлитных ДНК, образующих конститутивный гетерохроматин, часто содержат изгибы. Изгиб найден в центромерной ДНК всех 16 дрожжевых хромосом, подтверждая участие «изогнутой» ДНК в образовании центромерного комплекса. О роли адениновых блоков в изгибе сателлитной ДНК табака свидетельствуют эксперименты по сайт-направленному мутагенезу в элементах изгиба. Повторяющаяся единица сателлитной ДНК цитрусовых длиной около 181 п.н. также содержит характерные блоки адениновых остатков. При переходе к олигомерным формам изгибы, наблюдаемые в мономерах, способствуют образованию закрученной двойной спирали (CDH-форма).

Электронно-микроскопический анализ показывает наличие в гексамере сателлитных ДНК Artemia franciscana и Citrus ichangensis колец малого диаметра и толстых стержнеобразных частиц. Структурный консерватизм изгибов в сателлитных ДНК поддерживается сохранением А-блоков в повторах, при этом нуклеотидная последовательность самих повторов варьирует у разных видов. Наличие изгибов поддерживает гетерохроматиновую структуру сателлитных ДНК. Видоспецифические модификации сателлитного консенсуса включают изменения в положении и числе А-блоков. Молекулярная форма сателлитных олигомеров, предсказанная компьютерным моделированием, показывает закрученную структуру тандемных повторов, что хорошо согласуется с дендрограммой сателлитных последовательностей. По видимому, элементы, способствующие изгибу ДНК, определяют эволюцию сателлитных повторов.

 

6.1. КОМПЬЮТЕРНЫЙ АНАЛИЗ САТЕЛЛИТНЫХ ДНК CITRUS ИPONCIRUS

Для выявления локальных  изгибов в мономерах была использована программа CURVATURE. На рисунке 1 приведены профили изгибов 6 мономеров сателлитных ДНК Citrus и Poncirus.

Рисунок 1. Изгибы в отдельных клонированных повторах сателлитных ДНК цитрусовых.

Компьютерный анализ во всех повторах показал наличие стабильного  внутреннего изгиба ДНК. Все клоны  сателлитных ДНК цитрусовых, несмотря на высокий GC-состав (около 65 %), содержат несколько блоков адениновых остатков. Два адениновых блока локализованы у 3'-конца мономера и отстоят друг от друга на один виток спирали (10–11 п.н.). Такое расположение типично для большинства изогнутых природных молекул, например, в кинетопластной ДНК Leishmania tarantolae. В соответствии с этим наблюдением, программа CURVATURE показала максимальную изогнутость у 3'-конца (около 2,0 на динуклеотидный шаг). Максимальная величина изогнутости мономеров, длина которых 180–181 п.н., наблюдается у CL1, CI4 и PT11. Не может быть случайным тот факт, что эти изогнутые последовательности содержат адениновые блоки, состоящие из 5–6 адениновых нуклеотидов - dA5–6 (рисунок 2).

 

Рисунок 2. Электронномикроскопическое изображение гексамера сателлитной ДНК Citrus ichangensis. A – гексамер. B – контрольная ДНК той же длины.

В модельных экспериментах  максимальные изгибы получаются в молекулах ДНК B-формы, содержащих 5–6 последовательных адениновых остатков. Изгиб у PT3 относительно мал, так как в этой последовательности имеется более короткий адениновый блок (dA4). Кроме того, эта молекула обладает довольно выпуклым профилем изгиба, что может быть вызвано отсутствием аденинового блока в позиции 78. В целом, изгиб хорошо коррелирует с консервативным dA мотивом вовсех молекулах. Большинство мономеров содержат по крайней мере два, а в большинстве случаев три адениновых блока, что соответствует известному групповому расположению адениновых остатков в сателлитных ДНК. Такие же характерные адениновые блоки можно наблюдать и в сателлитных ДНК разных видов рода Cucumis. Беридзе и соавт. методом электронной микроскопии показали наличие колец малого диаметра и толстых стержнеобразных частиц в гексамере (рисунок2). Общеизвестно, что изгибы в ДНК ответственны за циркуляризацию олигомеров кинетопластов и синтетических молекул ДНК. Представляло интерес выяснить каким образом изгиб, наблюдаемый в мономере, потенциально может влиять на образование третичной структуры в длинных олигомерных ДНК. При помощи программы CURVATURE были проанализированы цепи искусственно лигированных «голова к хвосту» 12 мономеров сателлитных единиц, поскольку такая форма является наиболее часто наблюдаемой геномной организацией сателлитных повторов. Проекции указанных олигомеров показывают, что все тандемные повторы имеют тенденцию к образованию закрученной соленоидной структуры (рисунок 3).

Рисунок 3. Профили изгибов олигомеров сателлитных ДНК цитрусовых, содержащих 12 тандемно расположенных повторов.

Периодичность суперспирального повтора, определяемая как длина  суперспирального витка (п.н./виток) составляет от 600 п.н./виток для PT11 до 1000 п.н./виток для PT3. Более низкое значение периодичности (высокая степень суперспиральности) в 12-мерах PT11, CL5, CI4 и CS1 коррелирует с характером изгиба в мономерной единице (рисунок 2). Таким образом, можно констатировать, что теоретические предположения о суперспиральной структуре повторов Citrus и Poncirus хорошо соответствуют электронно-микроскопическим наблюдениям. Более того, контуры PT11, CS, CL и CI тандемов показывают сходную правую суперспиральность, подтверждая их эволюционное родство, в то время как эволюционно дивергированные повторы PT2 и PT3 образуют левый соленоид с более длинным суперспиральным витком (рисунок 3). Степень закрученности спирали может явиться важной структурной характеристикой сателлитного повтора. Секвенирование разных членов семейства сателлитных повторов часто обнаруживает значительную степень гетерогенности. Компьютерный анализ может помочь определить какие мутации влияют на третичную структуру ДНК, которая возможно играет важную роль при сворачивании хроматина, а какие мутации являются нейтральными и, вследствии этого, простым мутационным шумом. Изгиб в мономере означает, что длинные цепи сателлитной ДНК способны образовать специфическую третичную структуру – закрученную двойную спираль (CDH-форму). Возможно третичная структура сателлитной ДНК и наличие связывающих их специфических белков тесно взаимосвязаны. Эти белки могут фиксировать разные области сателлитных ДНК, способствуя образованию компактной третичной структуры, что со своей стороны может способствовать образованию компактного состояния конститутивного гетерохроматина [14].

 

6.2. ИЗГИБЫ ДНК И ЭВОЛЮЦИЯ ПОВТОРОВ

В геномах растений наблюдается  строгая тенденция к гомогенности повторов. Одинаковые типы повторов часто встречаются в разных хромосомах. Механизм гомогенности повторов пока еще полностью не ясен. В других организмах, включая животных, такой интенсивной интерлокусной гомогенности, поовидимому, не происходит. В Poncirus было обнаружено два типа сателлитов: первый (представленный клоном РТЗ), является уникальным для Poncirus и образует четко отделенную ветвь в эволюционном древе (см. рисунок 1), второй тип, представленный клоном РТ11, не является видоспециифичным. Возможно, эти сателлиты избежали процесса, приводящего к гомогенности, хотя и могут представлять разные хромосомные домены. Было показано, что дивергенция последовательности между обеими сателлитными группами сопровождается драматическими изменениями в структурных свойствах сателлитных ДНК, что находит отражение в изгибах ДНК. Поиск центров локальных изгибов показал, что в то время как некоторые А-блоки сохраняют свои позиции, число и расстояние между другими А-мотивами значительно изменяются. Это может свидетельствовать о том, что сравнительно простая перетасовка А-блоков и увеличение/уменьшение их числа может привести к существенным изменениям формы молекул с относительно гомогенной последовательностью, в особенности, если они представлены длинными тандемами. Понятно, что изменения в трехмерной структуре хроматина, определяемой углом между индивидуальными нуклеосомами, могут влиять на взаимодействие белков. Эти новые варианты могут быть или зафиксированы (приводя к образованию видоспецифичных рестрикционных сателлитов) или утрачены в результате рекомбинационных процессов. Таким образом, будет сохраняться баланс между разнообразием и гомогенностью гетерохроматина [7].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Глава 7

ЦЕНТРОМЕРЫ И  САТЕЛЛИТНЫЕ ДНК

 

Центромеры представляют собой очень cложную специализированную структуру хромосом. Цитологически они обнаруживаются в виде первичной перетяжки в метафазных хромосомах и участвуют в точном распределении хроматид в митозе и мейозе. Центромеры выполняют ряд функций: сцепление сестринских хроматид перед анафазой, предотвращение начала анафазы при отсутствии точного биполярного прикрепления веретена, связывание хромосом с аппаратом веретена и содействие движению хромосом. У большинства многоклеточных эукариот микротрубочки аппарата веретена не взаимодействуют непосредственно с ДНК хроматином центромерной области, а контактируют с белковой структурой, именуемой кинетохором, который со своей стороны тесно ассоциирован с центромерным хроматином. Иногда термин центромера используется для обозначения ассоциации центромерной ДНК (CEN ДНК) со связывающими ее белками (хроматин) и кинетохором. Интенсивные исследования по выяснению строения и функций этих структур отражены во многих статьях и обзорах [18].

 

7.1. СТРУКТУРНАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ЦЕНТРОМЕР

К настоящему времени интерес  исследователей сфокусирован на хромосомах многоклеточных эукариот с так называемыми локализованными центромерами. Следует, однако, отметить, что другие организмы показывают значительную вариабельность структуры центромер. К примеру, у некоторых простейших и S. cerevisiae микротрубочки не вставлены в сложный аппарат кинетохора. В голоцентричных хромосомах, обнаруживаемых у хорошо изученных Caenorhabditis elegans и других организмах (например, некоторых членистоногих), (голо)- кинетохор расположен вдоль всей или значительной части хромосом. Полицентрические хромосомы характеризуются многочисленными кинетохорами, которые распределены вдоль хромосомы, например, у некоторых покрытосеменных (Luzula, Cyperus) и членистоногих. Организация митотических и мейотических центромер/кинетохор может быть разной даже у одного и того же организма. В отличие от них, локализованные центромеры имеют одну область, которая образует перетяжку (первичная перетяжка) по отношению к хромосомным плечам. Имеется два класса локализованных центромер – точечные центромеры и региональные. Точечные центромеры упакованы в малые, компактные локусы и обнаруживаются у некоторых одноклеточных эукариот, таких как S. cerevisiae, Schizosaccharomyces uvarum, Kluyveromyces lactii, Candida maltosa, Candida glabrata и Yarrowia lipolytica. Наиболее хорошо изучена функциональная центромера S. cerevisiae, которая охватывает только 125 п.н. и содержит три консервативных элемента ДНК – CDEI, CDII и CDEIII, третий из которых (длиной 25 п.н.) абсолютно необходим для функционирования центромеры. Эти элементы связывают разные белковые факторы, Cbf1p, Cse4p и CBF3, которые, со своей стороны, контактируют с другими белками и микротельцами. Такая простая структура точечных центромер, по видимому, является результатом эволюции, так как другие грибы содержат большие региональные центромеры. Вместе с тем, обнаруживается эволюционная консервативность на разном уровне. Некоторые белки центромер S. cerevisiae  проявляют сходство с белками кинетохор других эукариот. Например, Cse4p представляет собой гистон H3-подобную молекулу, которая связывается с CDEII.

Анализ человеческого центромерного полипептида CENP-A показывает, что этот белок также произошел от гистона Н3. Другой пример – это ограниченная гомология центромерного белка дрожжей Mif2p с человеческим центромерным белком CENP-C и белком HCP-4 C. elegans. Региональные центромеры имеют более сложное строение ДНК. Их размер варьирует от 40 т.п.н. до нескольких мегабайтов. Большинство этих ДНК представлено повторяющимися элементами. Центромера S. pombe содержит разные повторяющиеся последовательности в виде длинных обращенных повторов, которые фланкируют 4–7 т.п.н. уникальную центральную область. Центромерные последовательности разных хромосом S. pombe умеренно консервативны. Центромерные ДНК S. cerevisiae и S. pombe довольно сильно различаются по строению. Необходимо заметить, что структура центромеры S. pombe сходна с центромерами некоторых других эукариот. У Drosophila размер минимальной функциональной центромеры составляет 420 т.п.н. Эту центромеру можно идентифицировать в экспериментах с использованием производных минихромосомы Dp1187, полученных облучением. Они содержат участки многократно повторяющихся тандемно расположенных последовательностей, перемешанных со сложной ДНК, состоящей из уникальных и среднеповторяющихся последовательностей. Около 350 т.п.н. этого участка состоит из двух простых повторов. В остальной части перемешаны целый транспозон и новая АТ-богатая последовательность. Центромерный транспозон обнаруживает значительную консервативность по сравнению с участками вне центромер.

Центромеры животных расположены  около или внутри длинной повторяющейся ДНК, которые охватывают участок длиной от 500 т.п.н. до нескольких мегаоснований. У приматов основная часть этих центромер представлена тандемной АТ-богатой повторяющейся последовательностью длиной 171 п.н., именуемой альфоидной ДНК. Иногда встречаются другие элементы типа Alu или ретротранспозонных элементов L1 (например, центромеры человека). Бросается в глаза, что за исключением Drosophila, длина сателлитного повтора довольно близка у разных организмов, включая растения, и соответствует нуклеосомной длине. Наши знания относительно центромер многоклеточных эукариот довольно ограничены. Однако некоторые публикации, появившиеся за последние годы, значительно улучшили понимание структуры и функции центромер. Сделано несколько важных наблюдений, касающихся центромер дрожжей, животных и человека. Хотя структурный анализ этих центромер не закончен, имеются значительные сомнения в существовании какой-то еще не обнаруженной «магической последовательности», способной быть «ядром» сворачивания большой области в функциональную центромеру. Этот взгляд поддерживается рядом исследований о наличии неоцентромер.