Сателитная ДНК

Полученные данные свидетельствуют  об отсутствии какой-то определенной последовательности ДНК и подтверждают точку зрения, согласно которой центромеры являются эпигенетической конструкцией ДНК-белкового комплекса, т.е. изменяющейся структурой, которая наследуется без соответствующего изменения последовательности ДНК. Другие интересные исследования касаются состава центромерных последовательностей. Несмотря на дивергенцию последовательностей, региональные центромеры дрожжей и животных имеют сходную «архитектуру». Центральная центромерная область состоит из нескольких однообразных сателлитных мотивов, фланкированных перицентромерными участками более сложной ДНК, включая разные повторяющиеся элементы, которые отличаются от основного сателлитного повтора. Эти фланкирующие участки всегда образуют гетерохроматин. Возможно, гетерохроматиновые перицентромеры представляют собой границу, которая отделяет гетерохроматиновый центромерный кор от эукариотических хромосомных плеч. Ряд исследований подтверждает, что упомянутые структурные домены одновременно являются и функциональными доменами. Не вызывает сомнений тот факт, что внутренняя область центромерного кора является областью связывания кинетохор. Однако эта область недостаточна для образования всей функционирующей центромеры. Возможно, перицентромеры имеют важное значение для сцепления сестринских хроматид или сестринских центромер. Следует заметить, что область перицентромерного гетерохроматина является поздно реплицирующейся. Ее репликации предшествует репликация центромерного кора, которой, в свою очередь, предшествует репликация эухроматиновых областей. По содержанию белков эти области четко различаются по ассоциации и/или модификации специфических белков. Наиболее заметна разница между эухроматином и центромерным гетерохроматином, которая заключается в наличии варианта гистона Н3 (CENP-A) в перицентромерной области, замещающего обычный Н3 гистон в нуклеосомах. Обнаруженный поначалу в человеческих клетках гомолог Н3 гистона позднее был найден в таких разных организмах, как дрожжи, C. elegans и Drosophila. Эти центромерные Н3 гистоны соответствуют нецентромерному Н3 гистону своим С-концевым доменом, однако NH2концевые домены у них различны. В моделях, объясняющих хроматин-зависимое эпигенетическое воспроизводство идентичности центромер, CENP-A и их гомологи играют существенную роль. При образовании новых центромерныхнуклеосом «нормальные» Н3-содержащие нуклеосомы должны исчезнуть, чтобы избежать постепенную потерю идентичности центтромер. Это может быть достигнуто образованием новых центромерных нуклеосом при помощи старых («модель узнавания»). Медиаторами этого процесса могут служить CENP-A гистон и специфические хроматиновые факторы.

Альтернативным (или дополнительным) вариантом к этому процессу может быть доступность центромерных гистонов только в ограниченное время и в ограниченном ядерном участке в течение клеточного цикла. Предполагается, что поздно реплицирующийся (пери)-центромерный гетерохроматин осуществляет этот процесс при помощи пространственного исключения нецентромерного Н3 гистона из этих доменов с одновременным накоплением центромерного Н3 гистона в то же время или в течение поздней репликационной стадии («секвестровая модель»). При помощи этой модели можно объяснить образование неоцентромер, что подчеркивает важную роль гетерохроматина для точного функционирования центромер. Рассмотрение накопившихся генетических, цитологических и молекулярных данных подтверждает, что региональныецентромеры растений могут иметь сходную с животными центромерами структурную и функциональную организацию [19].

7.2. КОМПОНЕНТЫ ДНК ЦЕНТРОМЕР РАСТЕНИЙ

Многократно повторяющиеся  центромерные последовательности, локализованные в гетерохроматине детально исследованы как у однодольных, так и двудольных растений. Обнаружены последовательности с разной степенью повторяемости в перицентромерах растений. Arabidopsis Genome Initiative приводит последовательности этих участков у Arabidopsis. Следует отметить, что перицентромерная ДНК включает в себя некоторые активные гены 5S РНК, митохондриальные последовательности, прямые повторы и повторы, сходные с теломерным. Присутствие теломерных последовательностей в центромерах показывает, что центромеры иногда могут образовываться Робертсоновскими слияниями теломер. Или же теломерные последовательности могут внедряться в центромерные элементы, как это обсуждалось для Arabidopsis. У кукурузы проанализированы центромерные последовательности обеих хромосом – А и В. Хромосома А является нормальной хромосомой, которая содержит генетическую информацию. Хромосома В является добавочной, часто гетерохроматиновой вдобавок к нормальному кариотипу и широко распространена среди растений и животных. Ее отсутствие почти не оказывает влияния на фенотип организма. Хромосома B кукурузы содержит элемент размером 9 млн.п.н., который состоит из тандемов 1,4 т.п.н. последовательностей и включает в себя функциональную центромеру. Повтор хромосомы В кукурузы имеет значительную гомологию с другим повторяющимся элементом – knob-последовательностью кукурузы длиной 185 п.н., являющейся основным элементом knob-гетерохроматина. Повторы В не встречаются в центромере хромосомы А, которая содержит другие повторы общим размером в млн.п.н. Один центрический элемент хромосомы А представляет собой повтор длиной 745 п.н. (Sau3A9 повтор), который обнаруживается и у других однодольных. Центромерный кор и фланкирующие области двудольных, например, томатов, содержат длинные цепи разных повторяющихся элементов.

Такая же картина наблюдается  и у Arabidopsis thaliana, где они состоят  из 180 п.н. повторов и родственных  производных (pAL1 повторы). С помощью FISH этот элемент был обнаружен во всех пяти центромерах Arabidopsis. В центромере обнаруживается также один ранее клонированный элемент (106 В), который представляет собой сильно измененную копию ретроэлемента Athila. Размер этих центромерных коровых доменов колеблется в пределах 1,1–2,9 млн.п.н. С использованием той же техники можно показать, что с центромерами Arabidopsis ассоциированы многие другие повторяющиеся элементы разной длины, отличающиеся от коровой последовательности. Эти перицентромерные области составляют около 1 млн.п.н. с обеих сторон центромерного кора и являются гетерохроматиновыми, также как и большая часть самого кора (за исключением кинетохорной области). Повторяющаяся природа центромеры характерна также для однодольных растений. В связи с этим следует заметить, что центромерная ДНК растений не всегда состоит из длинных тандемов повторяющихся элементов. Тандемные повторы не обнаружены и в центромере Vicia fab. Центромерная ДНК Tradescantia состоит из дисперсных повторов. Это возможно указывает, что возникновение центромер некоторых растений, подобно центромерам дрожжей, отличается от образования региональных центромер. Cледует отметить, что региональные центромеры дрожжей, Drosophila и человека имеют консервативный характер организации. Очевидно, такая же архитектура характерна и для растений [20].

7.3. ЭВОЛЮЦИЯ ЦЕНТРОМЕР РАСТЕНИЙ

Центромерные последовательности растений, дрожжей и животных претерпели быстрые эволюционные изменения. Это напоминает быструю эволюцию других повторяющихся элементов растений. Кукуруза представляет собой пример, когда центромеры разных хромосом в пределах одного вида содержат разные повторы. Так, повторы B хромосомы не обнаруживаются в центромерах А хромосом. Тем не менее, кукуруза, наряду с другими однодольными, обнаруживает консерватизм на уровне ДНК. Недавно последовательности центромеры хромосомы А были обнаружены в центромерах хромосомы В и knob-гетерохроматиновых областях. В предыдущей работе было показано, что, по крайней мере, один центрический элемент хромосомы А (Sau3A9 элемент размером 745 п.н.), клонированный из геномной библиотеки сорго, обнаруживает значительный консерватизм среди таких различных злаков, как кукуруза, рис, пшеница, ячмень, рожь и овес. Это доказывается флуоресцентной in situ гибридизацией и гибридизацией по Саузерну. Было также обнаружено наличие гомолога Sau3А9-повтора (элемент CS-1 размером 250 п.н.) у Brachipodum. При помощи FISH было показано, что он локализован также (в виде более или менее идентичных копий) в центромерах других однодольных растений. Интересно отметить, что эта последовательность, имеющая сходство с животным консенсусом CENP-B бокса, обнаруживается в 180 п.н. knob-повторе. CENP-B является центромеросвязывающим белком, который содержит домен спираль–виток–спираль.Вместе с тем выявляется, что центромерные повторы растений быстро эволюционируют. 180 п.н..ый элемент Arabidopsis thaliana не консервативен даже у близкородственных видов. Например, центромеры Arabidopsis arenosa содержат повтор (pAa214) с очень слабойгомологией к pAL1 повтору, в то время, как другие виды Arabidopsis (A. wallichii, A. pumila и A. griffithiana) не обнаруживают какoй-либо гомологии при проведении FISH-анализа. В результате у A. sueica, который, по-видимому, является гибридом A. thaliana x A. Aree nosa, оба повтора присутствуют раздельно в соответствуюших хромосомах.

Обнаружение существенных изменений  в центромерной ДНК неоцентромер доказывает, что наличие одной центромерной ДНК не всегда является достаточным и, более того, не всегда необходии мым для создания центромеры. Неоцентромеры – это локусы, временами выполняющие центромерные функции, хотя они не всегда обнаруживают все свойства нормальных центромер и которые раз возникнув, могут передаваться при клеточных делениях. Они обнаружены у человека, животных, Drosophila, а также растений. Хорошо изучена неоцентромера кукурузы с аномальной хромосомой 10. У большинства линий кукурузы хромосомы показывают нормальное поведение и в анафазе knob-гетерохроматин расположен за нормальной центромерой. У линии с хромосомой Ab10 knob-гетерохроматин становится неоцентромерным и обнаруживается впереди истинных центромер. Вместе тем наблюдается мейотический драйв в отношении knob-гетерохроматина и связанных с ним локусов. Эта система позволила выделить, по крайней мере, один супрессор образования неоцентромеры, Smd1, который возможно кодирует главный продукт, участвующий в образовании неоцентромеры или его сохранении [24].

7.4. ЦЕНТРОМЕРНЫЙ ГЕТЕРОХРОМАТИН И КИНЕТОХОР

Большая часть наших знаний о центромерных белках получена на основе исследований систем человека, животных и дрожжей. В последние  годы наблюдается значительный прогресс в изученицентромерных белков растений. Как известно, центромерные области  эукариот способствуют образованию  гетерохроматина, что обычно сопровождается потерей генной активности и способности к рекомбинации. У Arabidopsis в результате этого эффекта левая (пери)- центромера 1 разрезается и обнаруживается на стыке эу- и гетерохроматиновой границы в виде нескольких т.п.н. Недавние работы показали поразительное сходство растительных и животных центромер на белковом уровне. Так, фосфорилирование гистона Н3 (у серина-10) во время митоза имеет место у животных, некоторых растений и Tetrahymen. Это, однако, не исключает некоторых различий в тонких механизмах этого процесса. В частности,  у растений фосфорилирование гистона Н3 начинается внутри перицентромерной области, в то время как у животных – в позднереплицирующейся центромере. Другое заметное сходство между животными и растениями – это т.н. центромерный гистон Н3. Недавно был идентифицирован растительный гомолог (HTR12) и было показано его присутствие в центромерах Arabidopsis методом иммунолокализации. Следует отметить, что консерватизм этого компонента доказывается его присутствием в точечных центромерах S. cerevisiae и голоцентромере C. elegans.

Было бы интересно узнать, является ли метилирование гистона Н3 (в лизине-9 вместо лизина-4) на границе с гетерохроматином таким же характерным признаком для растений, как и наблюдаемое при делении дрожжей. Следует ожидать также наличия у растений неких специфических компонентов. Одним из них является SWITCH1-белок, который поддерживает сцепление сестринских хроматид у Arabidopsis и не обнаруживает гомологии ни с одним из известных в настоящее время белков. Другой пример касается белка РН1 кукурузы, который необходим для специфической ассоциации гомологичных центромер. Следует выяснить является ли он лишь специфическим растительным «изобретением». Кинетохор дрожжей и животных является чрезвычайно сложной центральной центромерной белковой структурой, необходимой для точного разделения, движения и распределения хромосом. Кинетохоры животных клеток триламинарны и состоят из разных слоев, содержащих белки с разными функциями. Самый дальний от центра слой или волокнистая корона содержит, поовидимому, моторные белки. За ним следует внешняя пластинка, которая взаимодействует с микротельцами. Следующий слой или интерзона содержит белки, которым приписывают сигнальные функции клеточного цикла. Лежащий глубоко внутри слой кинетохора – внутренняя пластинка – содержит белок типа CENP-C и центромерную ДНК, входя, таким образом в тесный контакт с центромерным гетерохроматином, который со своей стороны содержит большую часть CEN–ДНК и белки типа CENP-B, INCENP и др. Кинетохоры растений отличаются по ультраструктуре: они не организованы в виде слоев, а имеют глобулярную структуру, что придает кинетохору форму мяча, вставленного в хроматиновую чашу (модель «мяч и чаша»). Однако эта модель кинетохор растений на основе данных иммунофлуоресцентного анализа была недавно поставлена под сомнение. Консерватизм кинетохорного комплекса животных и растений была отмечена в экспериментах по иммунолокализации путем кросс-реакции белков центромер растений с антисывороткой людей, больных CREST (кальциноз, феномен Raynaud, склеродактилия, телангиэктазия) или с моноклональными антителами, образуемыми против животных белков. CREST является автоимунным заболеванием, которое ведет к образованию антикинетохорных антител. Как показано для ряда растений (Haemanthus, Tradescantia, кукуруза, Vicia faba) некоторые сыворотки CREST не вступают в реакцию с компонентами кинетохор растений.

Эти исследования недавно  были расширены за счет исследования антии тел, выработанных против синтетических  пептидов, полученных из гомологов белков кинетохор растений. Кинетохор однодольного растения Haemanthus katherinae был детально проанализирован сывороткой EK CREST. Кроме доказательства консервативности кинетохор животных и растений удалось показать, что кинетохоры этих организмов, цитологически различных, построены путем соединения сходных функциональных модулей. В этой модели структура CEN–ДНК, состоящая из тандемных повторов, определяет организацию кинетохора. Каждый повтор (или несколько комбинированных повторов) является функциональной единицей, способной к взаимодействию с соответствующими белковыми комплементами. Таким образом, кинетохор собран путем конденсации повторяющихся функционально идентичных субъединиц, расположенных вдоль повторяющейся нити ДНК. По существу, кинетохоры как растений, так и животных состоят из ряда независимых модулей. Минимальный размер модуля – одна нуклеосома (примером может служить почкующийся кинетохор дрожжей). Некоторые антигены меняют свое положение в процессе клеточного цикла, например антиген C6C меняет позицию от ядерной оболочки в профазе к кинетохору в мета- и анафазе. Известно, что ряд других белков животных также меняют свое местоположение. Это подтверждает гипотезу, согласно которой кинетохоры участвуют в процессе нуклеации микротрубочек и/или захвате уже сформированных микротрубочек. Кроме элементов, которые были обнаружены при помощи кроссреакций с сывороткой, комбинированными молекулярными, геномными и биоинформативными методами были идентифицированы дискретные компоненты кинетохор растений и ассоциированные с ним белки. Функции некоторых из них (CBF5, CENP-F, SKP1, мейотический гистон) все еще неясны и находятся в процессе изучения. Требуется доказать наличие в кинетохоре Arabidopsis гомолога ZW10 белка дрозофилы. Предполагается, что на ZW10 оказывает влияние натяжение клеточного центра и вследствие этого, он может служить показателем перехода от метафазы к анафазе. Этот белок двигается от кинетохора/центромеры в прометафазе к микротрубочкам кинетохора в метафазе и обратно к центромеру/кинетохору в анафазе. Предполагается также, что у кукурузы функцию  ориентира веретена выполняют антиген 3F3/2 и белок MAD2. Кинетохор обогащен белком MAD2 до связывания микротрубочек и веретено становится способным к натяжению в процессе созревания. Антиген CENP-E идентифицирован в Viciafaba и Hordeum vulgare как двигательный белок. В то же время, обнаружение γ-тубулина в кинетохорной области Vicia faba свидетельствует о консерватизме и, одновременно, о наличии специфических для растений свойств. С одной стороны, γ-тубулин является вариантом тубулина, обнаруживаемого у животных и образующего ядро зависимых от клеточного цикла микротрубочек, с другой стороны, у животных этот белок обычно является компонентом центросомных органелл, организующих веретено. Однако у покрытосеменных эти органеллы отсутствуют и вместо них имеются т.н. микротрубочкоорганизующие центры (MTOC). Это означает, что кинетохор представляет собой один такой MTOC. Наконец, один из хорошо изученных кинетохорных белков CENP-C обнаружен у ряда растений.