Сателитная ДНК

3.1. САТЕЛЛИТНЫЕ ДНК И МОБИЛЬНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ

Известно, что мобильные  элементы часто интегрируются в  состав гетерохроматина, где они накапливаются и могут служить источником новых семейств сателлитных ДНК. В ряде случаев наблюдается значительное сходство последовательностей сателлитных ДНК и фрагментов мобильных элементов. Последовательность pvB370, которая встречается в центромерном гетерохроматине у видов группы Drosophila virilis, очень сходна с длинным прямым повтором транспозона pDv. Главный гетерохроматиновый сателлит китообразных содержит длинные LINE-подобные повторы [12].

У животных «CENP-B бокс», т.е. связывающий сайт главного центромероспецифического белка (CENP-B), совпадает с терминальным обращенным повтором транспозона pogo. Принято считать, что CENP-B белок происходит от pogo-подобной транспозазы, а центромерный участок Y-хромосомы Droosophila melanogaster возможно образован путем амплификации внедренного в теломер ретротранспозона. SGM-семейство Drosophila guanche может служить моделью для понимания более общего пути образования сателлитных ДНК из мобильных элементов. Семейство SMG является мобильным элементом, характеризующимся функциональным и структурным сходством с миниатюрным транспозабельным элементом (MITE). Эти последовательности состоят из разных модулей. Они широко распространены у Drosophila и Sophophora, в частности у близкородственных видов D. subobscura, D. guanche и D. madeirensis. Но у D. guanche наблюдается отсутствующая у двух других видов амплифицированная сателлитная ДНК, составляющая 10% генома. Этот пример свидетельствует в пользу гипотезы, разработанной Салсером [4].

Глава 4

САТЕЛЛИТНЫЕ ДНК  РАСТЕНИЙ

К настоящему времени изучены  сателлитные ДНК большого числа  высших растений. Составлена специальная база данных этих молекул («PlantSat».). Высокая скорость эволюции этих последовательностей, приводящая к их значительной вариабельности, дает возможность дифференцировать родственные виды. Большая информация накоплена по культурным видам – пшенице, рису, овсу, а также по их диким сородичам (триба Poaceae). Детально исследованы также семейства Brassicaceae, Chenopodaceae, Cucurbitaceae, Solanaceae. Рестрикционные сателлитные ДНК найдены почти у всех растений. Главным образом, они сконцентрированы в субтеломерных и центромерных областях, однако иногда расположены и в интеркалирующих блоках хромосом [15].

Длина этих повторяющихся  ДНК нередко составляет 160–180 или 320–370 п.н. Однодольные растения часто содержат необычно большое количество сателлитных ДНК, обуславливающее феномен С-парадокса. Использование высокоразрешающей FISH-техники в мейотической профазе хромосом помогло точно локализовать Lycopersiconn специфические сателлиты в субтеломерных участках хромосом томатов (Lycopersicon esculentum). Наиболее полные молекулярные и цитологические данные получены для родов Beta, Nicotiana и Solanum. Наблюдается корреляция между длиной сателлитной ДНК и длиной нуклеосомной ДНК (кор + линкерная ДНК) (приблизительно 180 п.н.). У однодольных растений более длинные повторы произошли, по-видимому, путем дупликации отдельных последовательностей. Описаны видо-, родо- и семейство-специфические рестрикционные сателлиты, выявлена эволюционная скорость изменения последовательности повторяющегося элемента и предполагаемое время разделения видов внутри семейства. Показано, что сателлитные ДНК являются наиболее вариабельной частью генома с высокой скоростью молекулярной эволюции.

Распределение и последовательность сателлитных ДНК дает возможность  выявить филогенетическое родство  видов внутри семейств. Тот факт, что последовательность и количество повторов варьирует у относительно близких видов, позволяет их использовать для быстрого и простого скрининга гибридов, получаемых путем слияния протопластов. Arabidopsis Семейство многократно повторяющейся ДНК Arabidopsis (AtСon), состоит из 178 п.н. тандемно расположенных единиц, которые локализованы в центромерах всех пяти хромосомных пар. Анализ многих AtCon показывает консервативность последовательности, равную 95%. Внутри AtCon показано наличие двух боксов, длиной 30 и 24 п.н., которые консервативны на 99%. Последовательность у 3' конца этих боксов обнаруживает сходство с дрожжевой CDEI и человеческим CENP-B ДНК-белок связывающим мотивом. Когда олигонуклеотиды менее консервативных участков AtCon были гибридизованы in situ, они обнаруживались в специфических хромосомах. При ПЦР-анализе геномной ДНК одиночные праймеры или пары праймеров показывают незначительную амплификацию, что означает расположение повторов по типу голова к хвосту. Большинство пар праймеров, ориентированных в противоположном направлении, давали четкие полосы. Однако некоторые пары праймеров не давали амплификацию, показывая тем самым, что имеются хромосом-специфические варианты AtCon. Эти результаты очень важны, так как с их помощью можно оценить организацию, характер амплификации, распределение и эволюцию одного из главных семейств повторяющихся ДНК у Arabidopsis. Приведенные здесь данные подтверждают, что AtCon, по аналогии с сателлитами человека, может играть определенную роль в организации и функционировании центромер. Возможность использования сателлитных ДНК для оценки эволюционного родства растений детально исследована на примере разных видов Cucurbitaceae, включая культурные виды. Изучение этих видов представляет интерес, поскольку в их геноме содержится значительное количество специфических многократно повторяющихся ДНК. Характерные сателлитные элементы рода Cucumis описаны у C. sativus (типы I–IV), C. Melo (352 п.н.-ый повтор;) и C. metuliferus (346 п.н.). Реликты одного из них присутствуют во многих других видах Cucumis, а также в родственных родах в малых количествах, поэтому они обнаруживаются лишь после долгой экспозиции по Саузерну или ПЦР амплификацией. Это указывает на то, что оригинальный древний прародитель данного сателлита содержался уже у общего предка Cucumis, который был впоследствии модифицирован и развился в специфические субтипы.

Предположительно, видообразование  привело к отделению индийского подрода Сucumis (n = 7) от африканского подрода Мelo (n = 12). При видообразовании эти субтипы в одних видах были амплифицированы, в то время как в других остались в малых количествах. Самые значительные количества типов I–IV наблюдаются в культивируемой C. sativus (огурцы) и C. Hardwickii (менее культивируемый вид ). В культивируемых африканских видах 352 п.н. элемент превалирует у C. melo, и 346 п.н.-ый – у C. metuliferus. Сходные повторы в виде малых тандемных образований наблюдаются и у других видов. Поэтому отсутствие или наличие того или иного сателлита хотя и указывает на родство этих видов, однако не всегда является надежным филогенетическим маркером для классификации видов. Указанные элементы Cucumis четко отличаются от сателлитов, встречающихся в геномах тех видов Cucurbita, где найдены два главных типа повторяющихся элемента (170 п.н. и 350 п.н. повторы). У некоторых видов один или оба типа повторов претерпели небольшую модификацию и амплификацию, в то время как в других видах ПЦР амплификацией можно обнаружить лишь один тип. Для видов Cucumis характер распределения сателлитов отражает классификацию, основанную на морфологических, цитологических и других данных. Следует заметить, что у видов Cucumis группы Аnguria, которые широко не культивируются, не найдено охарактеризованных выше сателлитов. С другой стороны, тетраплоидные виды Cucurbita Нового Света содержат одинаковое количество внутри-межвидовых гетерогенных 179 п.н.-ых повтора, в то время как количество 350 п.н. сателлитов у разных видов варьирует. Таким образом, при изучении диких и культурных видов Cucurbitaceae удалось показать, что некоторые типы повторов, возможно, присутствующие у прародителей данной трибы, претерпели специфические изменения в последовательности и амплифицировались в процессе эволюции с образованием родо- или видо-специфических сателлитов. Ситуацию с видами Cucurbitaceae можно сравнить с «сателлитным поведением» родов Solanum и Lycopersicon, где «характерные для рода» повторы в малых количествах присутствуют даже в геномах других родов. Таким же образом, повторы, присутствующие в геномах разных видов рода Beta (Chenopodiceae), в малых количествах обнаруживаются и в других родах. Видо- или родо-специфические сателлитные повторы встречаются в зерновых культурах в виде амплифицированных геномных компонентов, в то время как в родственных диких видах они присутствуют в «молчащем» виде [13].

Механизм различного поведения этих сателлитов при окультуривании неизвестен, однако его знание может представлять некоторый интерес для селекции растений. Сателлитные ДНК цитрусовых растений детально охарактеризованы с использованием аналитического ультрацентрифугирования в градиенте плотности CsCl. У цитрусовых растений содержание сателлитных ДНК варьирует у разных видов, достигая в некоторых случаях 20% всего генома. GC-содержание этих фракций составляет 60–65%. Детально изучена последовательность и структура сателлитных ДНК Citrus limon, C. sinensis, C. ichangensis и Poncirumtrifoliata. Длина большинства мономеров составляет 181 п.н. с GC-составом 60–68%, что значительно выше среднего содержания GC в их суммарных геномах. Филогенетическаядендрограммаэтих последовательностей показывает, что последовательности Citrus отделены от большинства последовательностей Poncirus. Все повторы принадлежат к одному сателлитному семейству, однако претерпели видоспецифические модификации, которые отражают филогенетические отношения между видами. Внутри каждого вида можно наблюдать дифференциацию сателлитного повтора. Четко просматривается, что большинство повторов у двух культурных видов (лимон и апельсин) ближе друг к другу, чем к дикому виду C. ichangensis. Однако некоторые повторы одного вида более близки к повторам другого вида. Это может означать, что повторы не полностью гомогенны. Тем самым подтверждается, что дикий прародитель Citrus limon и C. sinensis были родственны с C. ichangensis, однако этот прародитель возможно вымер при окультуривании. Большинство повторов у более отдаленного вида P. trifoliata значительно дифференцированы, но все еще сохраняют 70–83% гомологию с другими цитрусовыми сателлитами. Большой набор последовательностей сателлитных ДНК можно использовать как ценный молекулярный маркер при изучении цитрусовых [3].

Глава 5

МЕТИЛИРОВАНИЕ САТЕЛЛИТНЫХ  ДНК

В ядрах всех эукариотических  клеток геномная ДНК конденсирована и компактизирована гистонами и  негистоновыми белками в динамическую структуру, именуемую хроматином. Активность хроматина регулируется ковалентными модификациями ядерных белков и ДНК. Метилирование цитозинового остатка в пятом положении пиримидинового кольца (m5C) является наиболее характерной модификацией ДНК у высших эукариот. Наследуемость молекулярных модификаций в ДНК создает основу для эпигенетической памяти. Важность метилирования ДНК в процессе развития убедительно доказана для животных и растений.

Распределение метилцитозина  в геноме далеко не равномерно. Большинство метилцитозиновых остатков сконцентрировано в гетерохроматиновых областях, сателлитных повторах, в неактивных транспозонах и эндогенных вирусах. С другой стороны, промоторные области некоторых генов, ассоциированных с CpG островками, и внеядерные геномы (ДНК пластид и митохондрий) обычно обходятся без метилирования. У животных метилирование обнаруживается в симметричных CG динуклеотидах, в то время как в растениях почти каждый цитозин может быть метилирован, хотя превалируют симметричные m5CG и m5CNG мотивы. У нитевидных грибов Neurospora и Ascobolus большая часть генома свободна от метилирования за исключением некоторых сильно метилированных повторяющихся последовательностей. ДНК некоторых организмов с малым размером генома, например S. cerevisia, D. melanogaster, C. elegans, не метилированы и программы их развития осуществляются с использованием других эпигенетических модификаций хроматина. Общий уровень метилирования у растений выше, чем у животных, что возможно отражает наличие большего количества сателлитных последовательностей (и гетерохроматина) в их геномах. Наблюдаются значительные различия в уровне метилирования у разных видов растений. К примеру, в то время как у Arabidopsis метилировано 6% цитозина, у большинства других покрытосеменных это цифра достигает 20–30%. Эти различия можно объяснить как количеством повторяющихся последовательностей, так и разным уровнем метилирования CNG последовательностей.

5.1.ФЕРМЕНТЫ, УЧАСТВУЮЩИЕ В МЕТИЛИРОВАНИИ

Наблюдается рост числа изолированных  генов (белков), связанных с процессом метилирования ДНК. Перенос метильной группы на цитозиновый оcтаток является пострепликативным энзиматическим процессом, катализируемым ДНК-метилтрансферазами. Эукариотические метилтрансферазы по сравнению с прокариотическими ферментами являются большими молекулами, часто размером более 100 кДа, и содержат разные функциональные домены. Хромодомены, обнаруженные недавно в малом семействе хромометилаз (СМТ-семейство), указывают на существование связи между структурой хроматина и метилированием ДНК. Высказано предположение, что хромодомены могут направить фермент к определенному геномному участку. В самом деле, у Arabidopsis и кукурузы разрушение хромометилазных генов приводит к специфическому снижению метилирования сателлитных последовательностей, указывая на сродство ферментов этого типа с гетерохроматиновыми участками. Обе мутации влияют больше на CNG, чем на CG метилирование. Механизм узнавания гетерохроматина возможно включает в себя взаимодействие фермента с гетерохроматин-специфическим НР1 белком у Arabidopsis. Интересно отметить, что взаимодействие НР1 с нуклеосомами происходит через метилированный гистон Н3, связывающий при этом две эпигенетические модификации, основанные на метилировании.

Функции CNG метилирования  в повторах остаются неясными, так  как ни один из хромометилазных мутантов не обнаруживает фенотипических отличий. Обнаружение ddm1 мутации у Arabidopsis в 90-ые годы показало, что метилирование эукариотического генома является сложным процессом, требующим помимо участия метилтрансфераз других факторов. В первых генерациях ddm1 мутантных растений наблюдается резкое снижение уровня метилирования сателлитных гетерохроматиновых участков – до 70%, в то время как гипометилирование в уникальных последовательностях обнаруживается лишь после нескольких поколений инбридинга. Оставалось загадкой, почему это происходит, когда у мутантных растений сохраняется нормальный уровень активности ДНК-метилтрансферазы и нормальный уровень кофакторов метилирования. Недавно мутации были увязаны с геном, кодирующим член семейства SNF2/SW12 ДНК-зависимой АТФ-азы, реконструирующим хроматин. Возможно в будущем будут открыты белки (гены), которые либо прямо (путем связывания метилтрансфераз через хромодомены), либо косвенно, например, через факторы, регулирующие доступность к хроматину, участвуют в процессе метилирования [17].

5.2. КЛЕТОЧНЫЕ ФУНКЦИИ МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК

Становится очевидным, что  метилирование цитозина может выполнять  и плейотропные функции в зависимости  от организма и локализации генома. У высших эукариот метилирование  может быть вовлечено в число  важных клеточных функций, таких как выключение генов, геномный импринтинг, инактивация транспозонов, тканеспецифическая экспрессия и эпигенетическая инактивация хромосомных доменов. Из этого следует, что обобщенная формулировка общей функции метилирования ДНК у эукариот является неправильной.

 В этом обзоре мы  рассмотрим вопрос о возможной  роли метилирования ДНК в сателлитах. Имеется ряд работ, показывающих  высокий уровень метилирования цитозина в сателлитных повторах в разных участках генома как у животных, так и у растений. Считается, что сателлиты, как и все повторяющиеся последовательности, являются исключительно хорошими мишенями для метилирования de novo. Доказательством этого являются полученные в трансгенных экспериментах данные, показавшие, что многие тандемно расположенные трансгенные копии подвергаются метилированию и отключению их экспрессии в процессе, именуемом умолчанием генов под воздействием повторов. Сигнал метилирования часто включает гомологозависимое взаимодействие между повторяющимися единицами (как тандемно расположенными, так и дисперсными) на уровне ДНК или РНК. Очевидно, что эндогенные сателлиты могут быть естественной мишенью для выключения  генов под воздействием повторов и метилирования. Эндогенные вирусы являются хорошим примером того, как одна или несколько копий чужой последовательности, однажды интегрированные в геном, могут расшириться, превратиться в сателлиты и претерпеть новые эпигенетические модификации.

В недавней эволюционной истории Nicotiana имела место интеграция растительной вирусной ДНК. В настоящее время ряд видов содержит около сотни копий амплифицированной и высокометилированной вирусной последовательности в геноме. Несомненно, не все сателлиты являются равнометилированными, к тому же не существует точной корреляции между числом копий и уровнем метилирования. Локусы рДНК являются хорошим примером повторяющейся последовательности, содержащей как гипо-, так и гиперметилированные единицы. Гипометилирование рДНК связывают с транскрипционной активностью и понижение метилирования, вызываемое 5-азацитидином, сопровождается повышенной транскрипцией исходно молчащих единиц у аллополиплоидов Brassica. Метилирование может способствовать компартментализации рДНК на активные и молчащие участки в клеточных ядрах. Возникает вопрос о роли метилирования цитозина в сателлитах, которые никогда не транскрибируются и образуют конститутивный гетерохроматин. Берд высказал предположение, согласно которому метилирование предотвращает нежелательный транскрипционный «шум» у видов с большим геномом. Частота сайтов, связывающих факторы транскрипции может быть высокой в геноме, значительную часть которого составляет гетерохроматин. В результате этого, следовые транскрипции, инициированные в гетерохроматине, могут достичь чрезвычайно высокого уровня.

Метилирование цитозина может непосредственно влиять на транскрипцию путем предотвращения связывания транскрипционных факторов с сайтом узнавания или же непрямым путем – образованием конденсированной структуры хроматина, недоступной для транскрипционных комплексов. Выделены белки с высоким сродством к метилцитозину у животных и показана их высококооперативная связуемость с ДНК. Возможно, некоторые из этих белков способствуют конденсации хроматина. Хотя транспозоны не рассматриваются как классические сателлиты, они могут составлять до 50% повторяющейся ДНК у некоторых видов растений, например кукурузы. У Arabidopsis мутации, влияющие на метилирование, могут увеличить активность транспозонов. И наоборот, активные транспозоны часто содержат меньше метилцитозина, чем их неактивные копии. Таким образом, метилирование может контролировать транспозиционную активность. Другая роль метилирования цитозина выяснилась в ходе недавних исследований в разных экспериментальных системах. У Ascobolus частота кроссинговера между двумя генетическими маркерами снижалась в сотни раз, в тех случаях, когда взаимодействующие ДНК были метилированы. Этот результат показывает, что метилирование может влиять на ДНК-ДНК взаимодействие и подавлять генетическую рекомбинацию в организме. Было показано, что редкий у людей ISN-синдром может быть связан с мутацией в метилтрансферазном гене DDM3 . Классическая сателлитная ДНК обычно сверхметилирована, но при ISN-синдроме почти полностью неметилирована. Цитогенетический анализ ISN-пациентов показал наличие хромосомных аберраций в центромерном гетерохроматине, в основном его удлинение в метафазе. В интерфазе наблюдалась устойчивая самоассоциация околоцентромерных сателлитов. Экспериментальное снижение метилирования вызывает абберантную конденсацию и разделение сестринских хроматид в субтеломерном гетерохроматине у пшеницы. У растений с большим геномом сателлитные повторы, состоящие из сотен тысяч единиц, часто обнаруживаются в разных хромосомах. Возможно, метилирование способствует предотвращению нежелательных рекомбинаций между гомологичными сателлитами в сдвинутых позициях.