Шпаргалка по "Микробиологии"

Тесты для количественного подсчета В-ЛИМФОЦИТОВ основаны на обнаружении некоторых поверхностных маркеров, к/х нет на Т-, но есть на В-лимфоцитах (поверхностных Ig, С3- рецепторов, специфических В-АГ). Количество В-лимфоцитов определяется по наличию на них рецепторов к СЗ-компоненту комплемента методом ЕАС–розеткообразующих клеток (ЕАС-РОК), которое в норме составляет 10–30% общего числа лимфоцитов.

Для определения концентрации СЫВОРОТОЧНЫХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ IgM, IgG и IgA (по Манчини) испольуется реакция преципитации в геле (тест иммунодиффузии) между АТ исследуемой сыворотки и АТ к IgM, IgG и IgA. Уровень сывороточных Ig отражает состояние В-системы иммунитета.

Для оценки факторов неспецифической  защиты определяют ФАГОЦИТАРНУЮ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ крови. О фагоцитарной активности судят по проценту фагоцитирующих клеток и среднему количеству микробных частиц, поглощенных одним лейкоцитом.

Тесты 2-го уровня позволяют провести более тщательный анализ иммунного статуса организма человека, позволяют уточнить характер дефекта, выявленного на предыдущем этапе с помощью ориентировочных тестов. К ним относят определение субпопуляций регуляторных Т-лимфоцитов (Т-хелперы / Т-супрессоры), оценку функциональной активности регуляторных и эффекторных субпопуляций Т-лимфоцитов и др. Большинство тестов 2-го уровня весьма трудоемки, результаты их могут быть получены не ранее чем через 3–7 сут.

22. Реакция агглютинации. Механизм, практическое использование.

Агглютинацией называется склеивание бактерий при действии на них специфических антител в присутствии электролита. Ее используют: 1) для определения вида и серовара выделенных бактерий (СЕРОТИПАЖ), 2) для обнаружения антител в сыворотке крови больного (СЕРОДИАГНОСТИКА).

Для постановки реакции агглютинации (РА) необходимы три компонента: Аг (агглютиноген), Ат (агглютинин) и электролит (изотонический раствор натрия хлорида). В качестве Аг в РА применяют взвеси живых и убитых бактерий (ДИАГНОСТИКУМЫ).

Для получения агглютинирующих  сывороток обычно иммунизируют кроликов. При этом им 5–7 раз подкожно, а  затем внутривенно с интервалами 2–7 суток в возрастающих дозах вводят взвесь убитых, а в конце – 2–3 раза живых бактерий. Через неделю после иммунизации определяют титр сыворотки, или максимальное ее разведение, которое агглютинирует гомологичный микроорганизм. Если титр сыворотки недостаточен, иммунизацию продолжают. Полученные таким образом агглютинирующие сыворотки называются неадсорбированными, поскольку содержат групповые агглютинины и могут в небольших разведениях склеивать родственные в антигенном отношении бактерии. Поэтому для опред-я вида б!! надо ставить развернутую реакцию с сывороткой, разведенной от 1:100 до ее титра. Сыворотка соответствует мкÒ-му в том случае, если как минимум агглютинирует его до половины титра.

Более достоверные результаты при определении вида или серовара бактерий дают адсорбированные (монорецепторные или типоспецифические) сыворотки, которые не имеют групповых агглютининов, вследствие чего нет необходимости разводить их. Реакцию агглютинации в них ставят на предметном стекле.

Ориентировочная, или пластинчатая, реакция агглютинации. Ориентировочную РА выполняют перед постановкой развернутой реакции для того, чтобы отобрать на среде агглютинирующиеся в сыворотке колонии бактерий (культуры) и исключить из дальнейших исследований неагглютинирующиеся. Ставят ее при комнатной температуре на предметном стекле. Для этого на его поверхность пастеровской пипеткой раздельно наносят 2–3 капли различных сывороток в разведениях 1:10–1:20 и каплю 0,5% раствора NaCl (контроль РА). В каждую каплю за исключением контрольной вносят подозрительные колонии (петлю культуры) и тщательно перемешивают до равномерного помутнения.

Результаты  реакции учитывают через несколько  минут невооруженным глазом. При  положительной реакции в каплях с сывороткой появляются крупные или мелкие хлопья, при отрицательной – жидкость остается равномерно мутной.

Развернутая реакция агглютинации для идентификации бактерий.

Ставят ее следующим образом. В агглютинационные пробирки предварительно разливают  по 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. В первую из них доливают 1 мл сыворотки, разведенной 1:100, и, смешав ее, 1 мл переносят во вторую, из второй – в третью пробирку и т. д. Получив двукратные разведения сывороток (от 1:100 до 1:1600 и более), вносят в них по 1–2 капли двухмиллиардной взвеси бактерий. Контролями служат изотонический раствор натрия хлорида с антигеном и исследуемая сыворотка без него. Пробирки энергично встряхивают и помещают на 2 ч в термостат при температуре 37°С, затем ведут предварительный учет, начиная с контрольных. Отсутствие агглютинации в контрольных пробирках и наличие взвешенных хлопьев в двух–трех и более пробирках опыта свидетельствуют о положительной реакции. Окончательные результаты учитывают через 18–20ч, выдерживая штатив с пробирками при комнатной температуре. Интенсивность реакции выражается плюсами: «++++» – сыворотка прозрачная, с хлопьевидным осадком склеившихся бактерий на дне пробирки; «+++» «++» и «+» – убывающие просветления с уменьшением бактериального осадка.

Реакция агглютинации для серодиагностики инфекционных болезней.

При использовании  РА для выявления в сыворотке  больных антител к соответствующему патогенному микробу или, как  кратко говорят, в целях серодиагностики  берут 5 мл крови, получают сыворотку  и разводят ее изотоническим раствором натрия хлорида от 1:50–1:100 до 1:800–1:1600, так как в более низких ее титрах могут находиться нормальные агглютинины, имеющиеся у здоровых людей или у больных с другим диагнозом.

В качестве Аг в этой реакции используют заведомо известные взвеси убитых мкÒ (ДИАГНОСТИКУМЫ), с которыми безопасно работать

РА для серодиагностики  ставится и учитывается так же, как и развернутая РА для определения  вида бактерий. Диагностическое значение имеют титры 1:100–1:200 и выше.

Более достоверные  результаты дает выявление нарастания титра антител в парных сыворотках, полученных от больного в начале заболевания и спустя 3–5 суток и более, когда титр агглютининов повышается под воздействием находящегося в организме патогенного микроба.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Ставится для обнаружения полисахаридов, белков, экстрактов бактерий, микоплазм, риккетсий и вирусов, иммунные комплексы которых с агглютининами в обычных классических РА увидеть не удается, или же для выявления антител в сыворотках больных к этим высокодисперсным веществам и мельчайшим микроорганизмам.

РНГА для серодиагностики инфекционных болезней. Используя РНГА для обнаружения антител в сыворотках больных, готовят ЭРИТРОЦИТАРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ ДИАГНОСТИКУМЫ. Для этого эритроциты обрабатывают 15 мин раствором танина в разведении 1:20 000–1:200 000, что придает им устойчивость и повышает адсорбционную способность. Затем их смешивают с известным антигеном и инкубируют в течение 2 ч при температуре 37°С.. Сенсибилизированные антигеном эритроциты 2–3 раза отмывают изотоническим раствором натрия хлорида и добавляют к сыворотке, разведенной и разлитой в лунки панелей. Контролем служат взвеси интактных и нагруженных антигеном эритроцитов, которые вносят в сыворотки, дающие заведомо положительную и отрицательную реакции.

Результаты  реакции учитывают через 2 ч после инкубации в термостате и оценивают плюсами: «++++» – эритроциты покрывают лунку в виде зонтика с неровными краями; «–» – скопление эритроцитов в виде «пуговицы»

23. Реакция преципитации. Её модификации.

Реакцией преципитации (РП) называется осаждение из раствора Аг (преципитиногена) при воздействии на него иммунной сыворотки (преципитина) и электролита. Посредством РП можно выявить антиген в разведениях 1:100 000 и даже 1:1 000 000, т. е. в таких малых количествах, которые не обнаруживаются химическим путем.

Преципитиногены представляют собой ультрамикроскопические частицы белково–ПС прир: экстракты  из мкÒ, органов и тк, пат материала; продукты распада бактериальной клетки, их лизаты, фильтраты. Преципитиногены обладают термоустойчивостью, поэтому для их получения материал подвергается кипячению. В РП используются жидкие прозрачные Аг.

Преципитирующие сыворотки обычно получают гипериммунизацией  кроликов циклами в течение нескольких месяцев, вводя им бактериальные  взвеси, фильтраты бульонных культур, аутолизаты, солевые экстракты микроорганизмов, сывороточные белки.

Постановка РП Асколи. В узкую пробирку с небольшим кол-вом неразведенной преципитирующей сыворотки, держа ее в наклонном положении, пипеткой медленно по стенке наслаивается такой же объем Аг. Чтобы не смешать две жидкости, пробирку осторожно ставят вертикально. При положительной реакции в пробирке на границе между сывороткой и исследуемым экстрактом через 5–10 мин появляется серовато–белое кольцо. Постановка реакции обязательно сопровождается контролями сыворотки и антигена.

Реакция Асколи применяется для идентификации  сибиреязвенного, туляремийного, чумного  Аг. Она нашла также применение в судебной медицине для опред-я  видовой принадлежности белка, в  частности кровяных пятен, в санитарной практике при выявлении фальсификации мясных, рыбных, мучных изделий, примесей в молоке. Недостатком этой РП является нестойкость преципитата (кольца), который исчезает даже при легком встряхивании. Кроме того, с ее помощью нельзя определить количественный состав Аг, участвующих в формировании преципитата.

Реакция преципитации Оухтерлони. Реакцию ставят на чашках Петри в лунках агарового геля. В качестве геля используют хорошо отмытый прозрачный агар. Аг и сыворотки вносятся в агаровый гель так, чтобы лунки, содержащие их, находились на определенном расстоянии. Диффундируя навстречу друг другу и соединяясь друг с другом, антитело и антиген образуют через 24–48 ч иммунный комплекс в виде белой полосы. При наличии сложного по составу преципитиногена возникает несколько полос. При этом полосы серологически родственных антигенов сливаются воедино, а полосы разнородных перекрещиваются, что позволяет определить детали антигенной структуры исследуемых веществ. Широко используется для диагностики заболеваний, вызываемых вирусами и бактериями, продуцирующими экзотоксины.

24. Реакция связывания комплемента.  Механизм и практическое использование.

Реакция связывания комплемента (РСК) – сложная двухэтапная серологическая реакция. В ней используют пять ингредиентов, составляющих две системы: антиген, антитело, комплемент (первая система); эритроциты барана, сенсибилизированные (обработанные) гемолитической сывороткой, содержащей специфические к ним антитела (вторая, или индикаторная, гемсистема). При этом взаимодействие антитела с антигеном на первом этапе реакции приводит к образованию иммунного комплекса, который адсорбирует комплемент, но визуально обнаружить это невозможно. В качестве индикатора связывания комплемента на комплексе антиген–антитело на втором этапе используют гемсистему, которая, являясь иммунным комплексом, тоже способна адсорбировать его. В конечном итоге возможны два варианта результата реакции. Если антитело и антиген соответствуют друг другу и комплемент адсорбируется образовавшимся комплексом, лизиса эритроцитов гемсистемы не произойдет. При несоответствии антитела антигену, и наоборот, комплемент, оставаясь свободным, присоединится к гемсистеме и вызовет гемолиз.

Как и другие серологические реакции, РСК можно  использовать для выявления специфических  антител по известному антигену или для определения антигена по известным антителам.

Общая характеристика ингредиентов РСК.

ИССЛЕДУЕМАЯ СЫВОРОТКА перед постановкой  реакции прогревается на водяной  бане 30 мин для инактивации ее собственного комплемента и разводится начиная с 1:5.

АНТИГЕНОМ могут  быть культуры бактерий, их лизаты, вирусы и вирус–содержащие материалы, экстракты  патологически измененных органов  и тканевые липиды.

КОМПЛЕМЕНТ  – сыворотка морских свинок, полученная в день опыта. В настоящее время  используется производственный сухой комплемент.

ГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА состоит  из смешанных в равных объемах  гемолитической сыворотки и 3% взвеси эритроцитов барана по осадку. Для  сенсибилизации эритроцитов гемолизинами смесь выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 30 мин.

Постановка основного  опыта РСК. В 1 пробирку вносят СЫВОРОТКУ, АНТИГЕН И КОМПЛЕМЕНТ, во вторую – сыворотку, комплемент и вместо антигена изотонический раствор натрия хлорида (КОНТРОЛЬ СЫВОРОТКИ), в третью – антиген, комплемент и тот же раствор натрия хлорида (КОНТРОЛЬ АНТИГЕНА). Пробирки ставят в термостат при температуре 37°С на 1ч. Одновременно готовят гемолитическую систему, которую затем добавляют во все три пробирки после извлечения штатива из термостата. Смешав гемсистему с ингредиентами трех пробирок, последние вновь ставят в термостат на 1 ч, и спустя это время учитывают результаты РСК.

При учете РСК интенсивность  реакции обозначается плюсами: «++++»– резко положительная реакция  с полной задержкой гемолиза, жидкость в пробирке бесцветная, все эритроциты осели на дно; «+++», «++» –положительная реакция, отличается нарастанием окраски жидкости вследствие гемолиза и уменьшения количества эритроцитов в осадке; «+» – слабоположительная реакция, жидкость интенсивно окрашена, на дне пробирки незначительное количество эритроцитов. Отрицательная реакция обозначается знаком «–», при этом наблюдается полный гемолиз, жидкость в пробирке имеет интенсивно–розовую окраску («лаковая кровь»).

РСК – весьма сложная, но очень  чувствительная специфическая реакция. Широко применяется в диагностике сифилиса, хронической формы гонореи, коклюша, актиномикоза, всех риккетсиозов и вирусных инфекций.

25. Реакция нейтрализации (реакция  нейтрализации токсина антитоксином; реакция вирусной нейтрализации  на животных, эмбрионах и клеточных культурах. Механизм и практическое использование).

Идентифицировать вирус по характеру  его действия на монослой культуры клеток, которые он разрушает или  вызывает в них разного рода структурные  изменения, очень трудно, и поэтому  прибегают к постановке реакции нейтрализации (РН) вирусов заведомо известными вируснейтрализующими сыворотками. С этой целью полученный от больного вирус накапливают в культуре клеток и различные его разведения смешивают с неразведенной противовирусной сывороткой или, наоборот, постоянную дозу вируса добавляют к различным разведениям иммунной сыворотки. Смеси инкубируют в термостате. После этого смесями вируса и сыворотки заражают культуру клеток и о нейтрализующей силе ее антител судят по отсутствию цитопатического действия на клетки Смесью вирусов и сывороток можно заражать куриные эмбрионы или чувствительных животных. В таких случаях нейтрализующую активность антител определяют по предотвращению развития патологических изменений на хорионаллантоисной оболочке; нейтрализации вирусных гемагглютининов в жидкостях эмбриона, устранению летального действия вируса на животных