Шпаргалка по "Микробиологии"

Подобным образом с помощью  РН идентифицируются вирусы, выделенные из материала больных при заражении  им куриных эмбрионов и животных. В таких случаях к вируснейтрализующим сывороткам прибавляют вируссодержащие жидкости эмбрионов и взвеси пораженных органов животных. После определенного времени инкубации смесями инфицируют культуры клеток, куриные эмбрионы и животных.

В серодиагностике вирусных инфекций РН определяют вирус–нейтрализующие антитела в сыворотке больных по известному вирусу. Ставят ее в динамике с парными сыворотками, одну из которых берут в разгаре заболевания, а вторую – спустя 2–3 недели, и по четырехкратному нарастанию титра антител в этой последней подтверждают диагноз.

26. Иммуноферментный анализ. Механизм  и практическое использование.

Метод был разработан в начале 70-х  гг независимо друг от друга тремя  группами учёных. Метод напоминает РИА, но в его основу положено маркирование Аг или Ат, вступающего в реакцию, ферментом. Взд метки с субстратом обычно сопровождается изменением окраски среды. В настоящее время созданы многочисленные модификации этого метода, но наибольшее распространение получил гетерогенный ИФА на твёрдой фазе (твердофазный). Различают:

ПРЯМОЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИФА. В этом случае:

сыворотку с Ат инкубируют с Аг, фиксированным на твёрдом субстрате (чаще всего это пластиковая микропланшетка).

Ат, не связавшие Аг, удаляют многократным промыванием.

Вносят меченную ферментом сыворотку к Ат, связавшим Аг.

Определяют ко-во фермента–маркёра, связавшегося с Ат.

КОНКУРЕНТНЫЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИФА.

Вносят сыворотку. Если в ней  есть специфические Ат, то они связываются  с Аг, фиксированном на твёрдом  субстрате. Если специфических Ат нет, то Аг оказывается не связанным.

При добавлении специфических к  фиксированному Аг Антител в первом случае им будет не с чем взаимодействовать (большинство Аг уже связаны) Þ содержание маркёра низкое. Во втором случае специфические Ат будут связываться с Аг и при отмывании они не будут смываться Þ высокое содержание маркёра.

Аналогично м.б. фиксированы АНТИТЕЛА, и различные фирмы выпускают  именно планшеты с уже фиксированными Ат.

По сравнению с классическими  методами выявления Аг этот метод  позволяет непосредственно регистрировать их взаимодействие с Ат, а не вторичные проявления (агглютинацию, преципитацию или гемолиз). Метод очень ЧУВСТВИТЕЛЕН (достаточно концентрации 1нг/мл).

Определяют: Хламидии, клостридии, ВИЧ  и др.

27. Реакция торможения гемагглютинации. Механизм и практическое использование.

Многие вирусы обладают способностью агглютинировать эритроциты строго определенных видов млекопитающих  и птиц. Так, вирусы гриппа и эпидемического паротита агглютинируют эритроциты кур, морских свинок, человека, а аденовирусы – эритроциты крыс, мышей. В связи с этим для их обнаружения в материале больных или культурах клеток, эмбрионов и животных ставят реакцию гемагглютинации (РГА). Для этого в лунках планшетов готовят двукратно возрастающие разведения вируссодержащих материалов и жидкостей, добавляя к ним отмытые изотоническим раствором взвеси NaCl эритроцитов. Для контроля спонтанной агглютинации эритроциты смешивают ещё с равным объемом изотонического раствора NaCl. Смеси инкубируют в термостате при температуре 37°С или при комнатной температуре.

Результаты РГА учитывают по характеру агглютинации эритроцитов  через 30–60 мин, когда они обычно полностью осаждаются в контроле. Положительная реакция обозначается плюсами. «++++» –осадок в виде «зонтика», «+++» – осадок с просветами, «++» – осадок с большими просветами, «+» –хлопьевидный осадок, окруженный зоной скомкованных эритроцитов, и «–» – такой же резко очерченный осадок эритроцитов в виде «пуговицы», как и в контроле

Являясь группоспецифической, РГА  не дает возможности определить видовую принадлежность вирусов. Их идентифицируют с помощью реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Для ее постановки используют заведомо известные иммунные противовирусные сыворотки, которые в двукратно снижающихся концентрациях разводят в изотоническом растворе натрия хлорида и разливают по лункам. К каждому их разведению добавляют равное количество вируссодержащей жидкости. Контролем является взвесь вируса в изотоническом растворе натрия хлорида. Планшеты со смесью сывороток и вируса выдерживают в термостате 30 мин или при комнатной температуре 2 ч, затем в каждую из них добавляют взвесь эритроцитов. Спустя 30 мин определяют титр вируснейтрализующей сыворотки (т.е. максимальное ее разведение), вызвавшей задержку агглютинации эритроцитов.

Используют РТГА в серологической диагностике вирусных болезней, в  частности гриппа и аденовирусных  инфекций. Ставить ее лучше так  же, как и РН, с парными сыворотками. Четырехкратное нарастание титра антител  во второй сыворотке подтверждает предполагаемый диагноз

28. Реакции фагоцитоза. Практическое  использование реакции фагоцитоза  при оценке иммунного статуса.

Фагоцитоз осущ-ся микрофагами и  макрофагами. Стадии фагоцитоза: приближение, прилипание, погружение, переваривание.

Оценка функциональной активности фагоцитирующих клеток.

Колич. оценку фагоцитарной активности гранулоцитов и моноцитов производят в цельной крови, в лейкоцитарной взвеси или в обогащенных фракциях фагоцитирующих клеток. В качестве стандартных объектов фагоцитоза используют монодисперсные частицы латекса диаметром 1,0-2,0 мкм, суспензию убитых нагреванием бактерий или дрожжеподобных грибов.

Фагоциты смешивают с фагоцитируемым материалом в соотношении 1:10 или 1:100 и инкубируют при 37°С в течение 30 мин при постоянном перемешивании. Затем пробирки центрифугируют и осадок ресуспензируют в капле сыворотки крови для приготовления мазка. В мазках, фиксированных краской Май-Чрюнвальда и окрашенных по Романовскому-Гимзе, подсчитывают процент фагоцитирующих клеток (ФП – фагоцитарный показатель) и кол-во поглощенных частиц на 1 клетку (ФЧ – фагоцитарное число).

У здорового человека ФП=40-80%, ФЧ=1-5.

29. Молекулярно-генетические методы обнаружения возбудителей инфекции в организме (ДНК и РНК зондирование, полимеразная цепная реакция).

В большей степени методы индикации  НК нашли применение в диагностике  вирусных инфекций, хотя существуют и  спец системы для индикации некоторых прихотливых бактерий (легионелл, хламидий, энтерококков, микобактерий и др).

Наиболее распространены МЕТОДЫ ГИБРИДИЗАЦИИ ДНК И РНК. Принцип: ДНК (и РНК) способны специфически связываться (гибридизироваться) с комплементарными фрагментами искусственно созданных нитей ДНК (РНК), меченых изотопами или ферментами (пероксидаза, ЩФ…). Затем образцы исследуют методом ИФА.

ПОЛИМЕРАЗНАЯ  ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ. Была предложена в 1983г. Принцип: многократное образование  копий (амплификация) определённого участка ДНК с помощью ДНК-полимеразы. ЭТАПЫ:

ТЕРМИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ 2-хнитевой ДНК  на отдельные цепочки (93-95°С в течение 30 секунд).

ОХЛАЖДЕНИЕ СРЕДЫ И ВНЕСЕНИЕ ПРАЙМЕРОВ, комплементарных нуклеотидным последовательностям обоих цепочек. Используют синтетические праймеры – олигонуклеиды из 10-20 НКт, взаимодействующих  с концами отдельных нитей  исходной ДНК. Точнее добавляют 2 праймера (комплиментарны). Взаимодействие праймеров называют ОТЖИГОМ (реакция проходит за 20-60 с при 50-65°С).

Вносят СПЕЦ ТЕРМОСТАБИЛЬНУЮ ПОЛИМЕРАЗУ (оптимум 70°С), к/я синтезирует вторичные  копии цепей ДНК (ампликоны).

Полученные 2-хнитчатые ДНК снова  подогревают, остужают, вносят праймеры и т.д.

Т.к. полимераза устойчива к воздействию t°С, то нет необходимости постоянно  её добавлять. После 30-80 циклов проводят идентификацию ДНК методом электрофореза. Подсчитано, что за 30-40 циклов из 1 матрицы  образуется 100.000.000 (100 млн) ампликонов. Для подтверждения принадлежности ДНК возбудителю молекулы можно подвергнуть рестрикции специфическими эндонуклеазами или провести ДНК-гибридизацию. ПЦР – оч чувствительный метод, теоретически достаточно иметь в среде лишь 1 молекулу ДНК.

Для ДИАГНОСТИКИ ИНФ ЗАБ-Й маркёром возбудителя явл его геном. Для  амплификации отбирают какой-нибудь УНИКАЛЬНЫЙ ген, наиболее отличающий его от других патогенов.

30. Биопрепараты для создания  активного иммунитета. Вакцины, анатоксины. Принципы их получения.

Препараты для иммунопрофилактики и иммунотерапии инфекционных заболеваний  делятся на:

вакцины и анатоксины – для индукции специфического иммунного ответа с  формированием активного противоинфекционного иммунитета за счет мобилизации механизмов иммунологической памяти;

иммунные сыворотки и Ig – содержат готовые специфические АТ (Ig), введение которых в Ò приводит к немедленному приобретению пассивного гуморального иммунитета, способного защитить организм от интоксикации или инфекции.

ВАКЦИНЫ (Э. Дженнер, Л. Пастер) – биопрепараты, предназначенные для создания активного искусственного иммунитета. Делятся на живые, убитые, химические, анатоксины и ассоциированные. Готовят т/же аутовакцины – из штаммов мкÒ, выделенных непосредственно из Ò чка.

ЖИВЫЕ ВАКЦИНЫ создают напряженный иммунитет, сходный с постинфекционным. Готовятся из АТТЕНУИРОВАННЫХ штаммов (т.е. вирулентные свойства утрачены, но при введении в Ò способны прижиться и вызвать выработку ВСЕХ ВИДОВ иммунитета). В большинстве случаев достаточно однократной вакцинации живой вакциной, т.к. вакцинный штамм может размножаться и персистировать в Ò. Применение живых вакцин опасно для людей (особенно детей) с врожденными или приобретенными иммунодефицитными состояниями → тяжелые инфекционные осложнения. Для получения используют следующие методы:

селекционный метод, направленный на выращивание мкÒ в неблагоприятных условиях отбор микробов со ↓ вирулентностью – классический метод получения живых вакцин (Пастер – сиб язва).

Адаптация мкÒ к Ò невосприимчивого Ж! или пассирование через ткани и органы, к/е не являются входными воротами для данного мкÒ.

Отбор мутантных штаммов со ↓  вирулентностью, выделенных из природы.

Методы генной инженерии.

УБИТЫЕ ВАКЦИНЫ готовят из мкÒ, обладающих максимально выраженной иммуногенностью. Их выращивают (на биопредприятиях), затем инактивируют t°С (55-60° в течение 1часа), УФ или хим в-вами (формалин, фенол, спирт и др) в условиях, исключающих денатурацию антигенов. Для профилактики – брюшного тифа, паратифов А и В, коклюша, бруцеллёза, лептоспироза… Для лечения – при вялотекущих и хронических инфекциях: бруцеллёз, туляремия, дизентерия, гоноррея, коклюш… Убитые вакциины создают ненапряжённый иммунитет.

Аттенуированный или убитый возбудитель  – это множество различных  АГ детерминант, но индуцировать защитный иммунитет могут немногие из них Þ очистить вакцинный препарат от токсичных или аллергизирующих компонентов. Выделение из Б!# АГ компонентов позволило получить вакцины второго поколения – ХИМИЧЕСКИЕ.    По сравнению с др вакцинами они менее реактогенны. Аналогами Б! хим вакцин являются вирусные субъединичные (расщепленные) вакцины, содержащие лишь некоторые наиболее иммуногенные компоненты вирионов (противогриппозная вакцина, включающая гемагглютинин и нейраминидазу). Субъединичные вакцины оказались наименее реактогенными, но и наименее иммуногенными.

Для ↑ ИММУНОГЕННОСТИ химических и субъединичных вакцин к ним  добавляют разного рода адъюванты (adjuvans – помогающий, поддерживающий): гидрооксид алюминия, алюминиево-калиевые квасцы, фосфат алюминия и др. Те же адъюванты добавляют для повышения иммуногенности и к препаратам анатоксинов.

АНАТОКСИНЫ получают путем обработки токсинов формалином (0,3% раствор) при температуре 37°С в течение 30 дней. При этом токсин утрачивает ядовитость, но сохраняет способность индуцировать синтез АТ. Анатоксинами широко пользуются для выработки активного антитоксического иммунитета при специфической профилактике столбняка, дифтерии и других инфекций, возбудители которых продуцируют экзотоксины.

ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ:

получение в чистом виде эпитопов и их связывание с молекулой-носителем (природные белки, синтетические  полиэлектролиты).

Генноинженерные методы: определяют гены, контролирующие нужные АГ детерминанты, переносят в геном других мкÒ и клонируют в них, добиваясь экспрессии этих генов в новых условиях.

На основе антиидиотипических антител.

Использование липосом для введения АГ. Благодаря их сходству с клеточными мембранами они не токсичны для Ò, заключенное в них вещество защищено от растворения в крови и они могут адсорбироваться на клетках. Такие «липосомные» вакцины вызывали тысячекратное усиление иммунного ответа.

Часть вакцин используется для обязательной ПЛАНОВОЙ ВАКЦИНАЦИИ детей: противотуберкулезная вакцина BCG, полиомиелитная вакцина, коревая, паротитная, АКДС.

Другие вакцины  обязательны для введения определенным контингентам в определенных районах (например, вакцина против клещевого  энцефалита) или при опасности  профессиональных контактов с возбудителем.

Общие требования к вакцинам: высокая иммуногенность, ареактогенность (отсутствие выраженных побочных реакций), безвредность и минимальное сенсибилизирующее действие.

31. Биопрепараты для создания  пассивного иммунитета. Лечебные  сыворотки и иммуноглобулины.  Принципы их получения.

Препараты для иммунопрофилактики и иммунотерапии инфекционных заболеваний делятся на:

вакцины и  анатоксины – для индукции специфического иммунного ответа с формированием  активного противоинфекционного иммунитета за счет мобилизации механизмов иммунологической памяти;

иммунные сыворотки  и Ig – содержат готовые специфические  АТ (Ig), введение которых в Ò приводит к немедленному приобретению пассивного гуморального иммунитета, способного защитить организм от интоксикации или инфекции.

ИММУННЫЕ СЫВОРОТКИ  И Ig

При многих инфекциях АТ играют защитную роль. Однако накопление достаточного количества антител наблюдается, как правило, не ранее чем через 2-3 нед после начала заболевания. Поэтому искусственное создание пассивного иммунитета показано при многих инфекциях как с целью серотерапии, так и с целью экстренной серопрофилактики (при непосредственной угрозе заболевания).

Иммунные сыворотки  получают путем гипериммунизации лошадей, от которых можно получить сравнительно много крови, с последующей обработкой иммунной сыворотки (для концентрации АТ и очистки от балластных веществ методами ферментирования и диализа («Диаферм»)).