Шпаргалка по "Микробиологии"

Первично трипсинизированные культуры используются ТОЛЬКО 1 РАЗ.

2) ПОЛУПЕРЕВИВАЕМЫЕ  КЛЕТКИ. Их можно перевивать 50-100 раз. В основном это диплоидные ##.

3) ПЕРЕВИВАЕМЫЕ (БЕССМЕРТНЫЕ) – это раковые клетки: Hela, Hep-1, Hep-2 – были получены в 50-х гг, затем их постоянно пересеивали. В этом случае из старой пробирки выливают пит среду и добавляют ВЕРСЕН, под его влиянием ## отлипают. Взвесь клеток с этим в-вом центрифугируют, ## оседают, версен сливают и добавляют поддерживающий пит раствор. Т.о., снова получают готовую культуру.

Вирусы в  клеточной культуре выявляют по их цитопатическому действию:

1) по образованию  ими на среде сплошного (газонного)  роста бесклеточных "бляшек"

2) по вакуолизации клеток культуры

3) появлению  клеточных включений

Также используются электронная микроскопия и серологические реакции.

26. Бактериофаги. Морфология, взаимодействие  с клеткой, культивирование, практическое  использование.

Бактериофаги (греч. phagos – пожирающий) – это в!!, паразитирующие на б!!, были открыты 1917 г. В настоящее время, кроме бактериофагов, известны фаги микоплазм, грибов, дрожжей, синезеленых водорослей.

Строение и химический состав фагов. Как в! имеет очень малые размеры, примерно 100-200 нм. Различают простые и сложные, РНК– и ДНК–содержащие фаги. Простые РНК–фаги имеют круглую или нитевидную форму. Наиболее хорошо изученные сложные фаги эшерихий имеют вид барабанной палочки с шестигранной головкой, в которой находится ДНК. Имеют отростки, к/е состоят из полого стержня, снаружи покрытого сократительным чехлом. На дистальном конце отростка находится шестиугольная базальная пластинка с шестью отходящими от нее нитями–рецепторами.

Фазы взаимодействия фага с бактериями. При эффективном взаимодействии сложный фаг эшерихий адсорбируется на бактериях дистальным концом отростка. При этом из–под его базальной пластинки выделяется лизоцим, который вызывает образование в оболочке эшерихий отверстия. Вслед за этим происходит сокращение головки и чехла фаговой частицы, проникновение через цитоплазматическую мембрану кончика его стержня и выход в цитоплазму фаговой ДНК. После ее введения следует фаза смены информации и последующий синтез ДНК и белка фага. На заключительном этапе взаимодействия фага с бактерией происходит самосборка фаговых частиц.

Следствие взаимодействия фага с бактерией. Полный цикл развития фагов продолжается до 1,5ч, в течение которых образуется 100–200 фаговых частиц, что заканчивается лизисом бактерий под влиянием фагового лизоцима. Фаги, обусловливающие лизис микробов и формирование новых фаговых корпускул, называются вирулентными. Наряду с вирулентными в природе имеются умеренные фаги, их взаимодействие с бактериями проявляется в двух формах: одни штаммы или клетки определенного вида бактерий они разрушают, в другие проникают, но гибели не вызывают. В последнем случае геном умеренного фага интегрирует в геном бактерии и в дальнейшем воспроизводится вместе с ним при делении #. Умеренный фаг, наследственные детерминанты к/го объединились с бактериальными, называются профагом; бактерии, содержащие профаг, – лизогенными, а само явление– лизогенией.

Связь профага  с бактерией очень прочная  и в естественных условиях нарушается оч редко (спонтанная продукция фага). Частоту отщепления профага от бактериальной хромосомы можно увеличить, воздействуя на лизогенные бактерии ультрафиолетовыми лучами, ионизирующей радиацией, магнитным полем и химическими мутагенами (индукция лизогенных бактерий).

Выявление. Как и в!! животных, фаги обнаруживаются под электронным микроскопом и по эффекту их действия на чувствительные микробы. При этом, размножаясь в бульонных культурах, они вызывают просветление среды, а на агаровых газонах подавляют рост бактерий в местах их внесения или формируют колонии в виде мелких стерильных (негативных) пятен – бляшек фага. Подобно колониям бактерий, морфология бляшек специфична для различных фагов. Вирулентные фаги обычно образуют прозрачные бляшки, а умеренные – мутные.

Распространение. Фаги обнаруживаются во всех объектах окружающей среды, в которых обитают бактерии, актиномицеты, грибы, микоплазмы. Найдены они в воде, почве, молоке, в различных выделениях человека и животных.

Получение и практическое применение. Фаги получают путем фильтрации и очистки лизированных ими бульонных культур бактерий. Готовый препарат фага представляет собой прозрачную желтоватую жидкость. В целях повышения стабильности фильтрат фаголизатов таблетируют.

Используются  фаги главным образом для ИДЕНТИФИКАЦИИ  И ВНУТРИВИДОВОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ. Для этого применяют наборы типоспецифических фагов, лизирующих определенные варианты бактерий. Особую ценность метод фаготипирования приобретает при эпидемиологическом обследовании очага, где с его помощью удается выявить источники и пути передачи инфекции.

Узкоспецифический спектр действия фагов ограничивает широкую возможность их использования  как ЭТИОТРОПНЫХ ПРЕПАРАТОВ. Для  лечения в основном применяют  стафилококковый и стрептококковый  бактериофаги и колибактериофаг. Они  представляют собой фильтраты фаголизатов соответствующих бактерий, их выпускают в запаянных ампулах или флаконах. Эти препараты назначают при нагноительных процессах, вызванных фагочувствительными штаммами стафилококка, стрептококка и кишечной палочки, орошая ими инфицированную рану или обкалывая очаг воспаления.

В целях ПРОФИЛАКТИКИ фагирование в настоящее время  проводят только в очагах брюшного тифа и дизентерии. Взрослые люди, находившиеся в контакте с больными, принимают  указанные бактериофаги внутрь за 1,5–2 ч до еды по 1–2 таблетке (в дизентерийном очаге 2–3 раза с интервалом 3 дня).

27. Методы микроскопии в микробиологии.  Их практическое применение.

Размеры микробов, имеющих клеточное  строение, составляют 0,2–20 мкм и  они легко обнаруживаются в иммерсионном микроскопе. Вирусы во много раз меньше. Диаметр самых больших из них, например вируса натуральной оспы, около 300 нм, а у самых мелких составляет 20–30 нм. Ввиду этого для выявления вирусов используются электронные микроскопы.

В микробиологических исследованиях применяют световые и электронные микроскопы; методы оптической и электронной микроскопии.

Оптический микроскоп. Наиболее важной оптической частью микроскопа являются объективы, которые делятся на сухие и иммерсионные.

Сухие объективы с относительно большим фокусным расстоянием и слабым увеличением применяются для изучения микроорганизмов, имеющих крупные размеры (более 10–20 мкм), иммерсионные (лат. immersio – погружение) с фокусным расстоянием – при исследовании более мелких микробов.

При микроскопии иммерсионным объективом х90 обязательным условием является его погружение в кедровое, персиковое или в вазелиновое масло, показатели преломления света у которых близки предметному стеклу, на котором делают препараты. В этом случае падающий на препарат пучок света не рассеивается и, не меняя направления, попадает в иммерсионный объектив. Разрешающая способность иммерсионного микроскопа находится в пределах 0,2 мкм, а максимальное увеличение объекта достигает 1350.

При использовании иммерсионного  объектива вначале центрируют оптическую часть микроскопа. Затем поднимают конденсор до уровня предметного столика, открывают диафрагму, устанавливают объектив малого увеличения и при помощи плоского зеркала освещают поле зрения. На предметное стекло с окрашенным препаратом наносят каплю масла, в которую под контролем глаза осторожно погружают объектив, затем, поднимая тубус, смотрят в окуляр и вначале макро–, а потом микровинтом устанавливают четкое изображение объекта. По окончании работы удаляют салфеткой масло с фронтальной линзы объектива.

Микроскопия в темном поле зрения проводится при боковом освещении и обычно применяется при изучении подвижности бактерий или обнаружении патогенных спирохет, поперечник которых может быть меньше 0,2 мкм. Чтобы получить яркое боковое освещение, обычный конденсор заменяют специальным параболоидом–конденсором, в котором центральная часть нижней линзы затемнена, а боковая поверхность зеркальная. Этот конденсор задерживает центральную часть параллельного пучка лучей, образуя темное поле зрения. Краевые лучи проходят через кольцевую щель, попадают на боковую зеркальную поверхность конденсора, отражаются от нее и концентрируются в его фокусе. Если на пути луча нет каких–либо частиц, он преломляется, падая на боковую зеркальную поверхность, отражается от нее и выходит из конденсора. Когда луч встречает на своем пути микробы, свет отражается от них и попадает в объектив – клетки ярко светятся. Так как для бокового освещения необходим параллельный пучок света, применяется только плоское зеркало микроскопа. Обычно исследование в темном поле зрения проводится под сухой системой. При этом небольшую каплю материала помещают на предметное стекло и накрывают покровным, не допуская образования пузырьков воздуха.

Фазово–контрастная  и аноптральная микроскопия основаны на том, что оптическая длина пути света в любом веществе зависит от показателя преломления. Это свойство используют с целью увеличить контрастность изображения прозрачных объектов, какими являются микробы, т. е. для изучения деталей их внутреннего строения. Световые волны, проходя через оптически более плотные участки объекта, отстают по фазе от световых волн, не проходящих через них. При этом интенсивность света не меняется, а только изменяется фаза колебания, не улавливаемая глазом и фотопластинкой. Для повышения контрастности изображения фазовые колебания при помощи специальной оптической системы превращаются в амплитудные, хорошо улавливаемые глазом. Препараты в световом поле зрения становятся более контрастными – положительный контраст; при отрицательном фазовом контрасте на темном фоне виден светлый объект. Вокруг изображений нередко возникает ореол.

Большей четкости изображения малоконтрастных живых  микробов (даже некоторых вирусов) достигают  в аноптральном микроскопе. Одной из важнейших его деталей является линза объектива, расположенная вблизи «выходного» зрачка, на которую нанесен слой копоти или меди, поглощающий не менее 10 % света. Благодаря этому фон поля зрения приобретает коричневый цвет, микроскопируемые объекты имеют различные оттенки – от белого до золотисто–коричневого.

Люминесцентная микроскопия основана на способности некоторых клеток и красителей светиться при попадании на них ультрафиолетовых и других коротковолновых лучей света. Люминесцентные микроскопы представляют собой обычные световые микроскопы, снабженные ярким источником света и набором светофильтров, которые выделяют коротковолновую часть спектра, возбуждающую люминесценцию. Между зеркалом микроскопа и источником света устанавливают сине–фиолетовый светофильтр (УФС–3, ФС–1 и пр.). На окуляр надевают желтый светофильтр (ЖС–3 или ЖС–18).

Различают собственную (первичную) флюоресценцию и наведенную (вторичную). Так как большая часть  микробов не обладает собственной флюоресценцией, они обрабатываются красителями, способными флюоресцировать (вторичная люминесценция). В качестве флюорохромов используют аурамин (для обработки микобактерий туберкулеза), акридин желтый (гонококки), корифосфин (коринебактерии дифтерии), флюоресцеинизотиоцианат (для мечения антител).

Люминесцентная микроскопия отличается рядом преимуществ: дает цветное  изображение и значительную контрастность; позволяет обнаружить живые и  погибшие микроорганизмы, прозрачные и непрозрачные объекты; установить локализацию бактерий, вирусов и их антигенов в пораженных клетках организма.

Электронный микроскоп. В электронном микроскопе вместо света используется поток электронов в безвоздушной среде, на пути которых находится анод. Источником электронов является электронная пушка (вольфрамовая нить, разогреваемая до 2500–2900 °С). Оптические линзы заменены электромагнитами. Между вольфрамовой нитью и анодом возникает электрическое поле в 30 000–50 000 Вт, что сообщает электронам большую скорость, и они, проходя через отверстие анода, попадают в первую электромагнитную линзу (конденсор). Электронные лучи на выходе из конденсора собираются в плоскости исследуемого объекта. Они отклоняются под разными углами за счет различной толщины и плотности препарата и попадают в объективную электромагнитную линзу, снабженную диафрагмой. Электроны, незначительно отклонившиеся при встрече с объектом, проходят через диафрагму, а отклонившиеся под большим углом – задерживаются, благодаря чему обеспечивается контрастность изображения. Линза объектива дает промежуточное увеличение изображения, которое наблюдается через смотровое окно. Проекционная линза может увеличивать изображение во много раз. Это изображение принимается на флюоресцирующий экран и фотографируется. Разрешающая способность электронных микроскопов равна 1,0 –0,14нм

28. Понятие о гене и этапах  развития генетической системы. Генетический аппарат бактерий.

Ген – стр.-функц. единица хромосомы, отвечающая за наличие и функционирование определенного белка в клетке (организме).

В бактериальной хромосоме выделяют ряд участков:

1) промотор – участок ДНК,  распознаваемый ДНК-зависимой-РНК-полимеразой.

2) оператор – участок ДНК,  промотором и структурным геном,  с которым связывается белок-репрессор.

3) Оперон – содержит регуляторный  ген, промоторный участок, область  оператора и последовательность  генов, регулируемых данным опероном. Он является функц.-генетической единицей.

Ген-регулятор кодирует белок-репрессор, связывающий оператор и индуктор. Нет индуктора – оперон "молчит", появляется индуктор – оперон "работает".

Белок-репрессор – распознает нуклеотидную последовательность ДНК.

(Lac-оперон – индуцибельный оперон, контролирующий синтез ферментов по обеспечению бакт. клетки лактозой).

Бактерии относятся к царству  прокариот, отличаются от эукариот тем, что содержат 1 ХР, к/я представлена 2-хцепочечной ДНК, кольцевидной формы, в ней содержится вся наследственная информация (ГЕНОТИП). Она фиксируется на мезосоме, и при делении # мезосома перемещает нити ДНК в дочерние ##. Иногда этот процесс опережает деление самой клетки, тогда в 1 Б! может оказаться 2 хр. Хромосома б! не содержит ГИСТОНОВ, в # нет ЦЕНТРОМЕРОВ, делится только МИТОЗОМ. Также Б! отличаются РАЗМЕРАМИ.