Бактериологический метод исследования

Бактериологический метод исследования

Бактериологический метод заключается в выделении чистой культуры возбудителя (популяции, содержащей бактерии одного вида) и идентификации этого возбудителя является основным методом бактериологического исследования

Изучение свойств микроорганизмов в бактериологической лаборатории с целью установления принадлежности к той или иной систематической группе (виду, роду) и называется их идентификация.

В целом бактериологический метод исследования представляет собой многоэтапное бактериологическое исследование, которое длится 18— 24 часов

При бактериологическом методе в анаэростат помещают посевы анаэробов. Из аэростата удаляют воздух и заменяют его газовой смесью, которая не содержит кислород.

Основой бактериологического метода является выделение чистой культуры возбудителя, которое происходит на первом этапе исследования. Для выделения чистой культуры возбудителя делают посев взятого материала. Посев делается, как правило, на плотные питательные среды, которые выбирают исходя из свойств предполагаемого возбудителя.

При бактериологическом методе применяют по возможности среды, на которых растет только конкретный вид бактерий — элективные среды, или среды, позволяющие отличить предполагаемого возбудителя от других микроорганизмов или по-другому дифференциально-диагностические среды.

Например, при бактериологической диагностике кишечных инфекций — среду Эндо, для выделения дифтерийной палочки используют теллуритовые среды, и т. д. При выделении условно-патогенных микроорганизмов при бактериологическом методе посев взятого материала осуществляют на универсальные питательные среды. Примером такой среды может служить кровяной агар.

Все манипуляции, которые связанны с выделением бактериальных культур, проводятся над пламенем горелки.

При бактериологическом методе посев материала на питательные среды производят либо стеклянным или металлическим шпателем, либо бактериальной петлей таким образом, чтобы находящиеся в исследуемом материале бактерии рассеять по поверхности питательной среды. В результате такого рассеивания каждая бактериальная клетка попадает на свой участок среды.

При выделении из патологического материала чистой культуры возбудителя, который существенно загрязнен посторонней микрофлорой, часто пользуются биологическим методом выделения чистой культуры. Делают это следующим образом: заражают исследуемым материалом чувствительных к возбудителю лабораторных животных. Еще один пример биологического метода — при исследовании больного на содержание в мокроте пневмококков, материал внутрибрюшинно вводят белым мышам. Из их крови через 4-6 часов получают чистую культуру пневмококка.

В том случае, если в результате бактериологического метода исследования предполагается в исследуемом материале содержание малого количества возбудителя, посев производят на жидкую питательную среду для его накопления, так называемую среду обогащения, которая оптимальна для данного микроорганизма. Далее осуществляют пересев из жидкой питательной среды на плотные среды, разлитые в чашках Петри. Засеянную возбудителем среду помещают в термостат обычно при определенной температуре, что важно для бактериологического метода.

На втором этапе бактериологического метода исследования проводят изучение колоний бактерий, выросших на плотной питательной среде и происходящих от одной бактериальной клетки. (колония и является чистой культурой возбудителя). Производят микроскопическое и макроскопическое исследование колоний в отраженном и проходящем свете: невооруженным глазом, под малым увеличением микроскопа, с помощью лупы.

Отмечают культуральные свойства колоний: их форму, величину, цвет, характер краев и поверхности, структуру, консистенцию. Далее для приготовления мазков используют часть каждой из намеченных колоний. Окрашивают мазки по Граму, микроскопируют, определяя тинкториальные (отношение к окраске) и морфологические свойства выделенной культуры и проверяя одновременно ее чистоту.

Оставшуюся часть колонии пересевают в пробирки с оптимальной для данного вида средой, например, скошенным агаром, с целью накопления чистой культуры для более полного ее изучения. Пробирки перемещают на 18–24 часа в термостат. На втором этапе, кроме перечисленных исследований, нередко подсчитывают количество выросших колоний.

Это имеет особенное значение при заболеваниях, вызванных условно-патогенными микроорганизмами. При таких заболеваниях судить о ведущей роли какого-либо возбудителя допустимо лишь по его содержанию в патологическом материале в достаточно большом количестве и преобладанию этого возбудителя над другой флорой.

Для того чтобы провести такое исследование готовят последовательные разведения взятого исследуемого материала, из которых на чашки с питательной средой производят высев, подсчитывают количество выросших колоний, умножают на разведение, из чего определяют содержание микроорганизмов в материале.

Идентификация выделенной чистой культуры возбудителя и определение для этой культуры чувствительности к антибиотикам и другим химиотерапевтическим препаратам — третий этап бактериологичестого метода. Идентификацию выделенной бактериальной культуры производят по тинкториальным, морфологическим, биохимическим, культуральным, токсигенным, антигенным свойствам.

Первым делом берут мазок из культуры, выросшей на скошенном агаре, исследуют морфологию бактерий и проверяют чистоту культуры выросших бактерий. Далее осуществляют посев выделенной чистой культуры бактерий на среды Гисса. Желательно провести посев и на другие среды для определения биохимических свойств.

Ферментативные, или биохимические, свойства бактерий обусловлены ферментами, которые участвуют в расщеплении белков, углеводов, вызывающими восстановление и окисление различных субстратов.

Причем каждый из видов бактерий производит постоянный для него набор ферментов. Чаще всего при изучении антигенных свойств используют реакцию агглютинации на стекле.

С помощью реакции нейтрализации токсина антитоксином in vivo или in vitro определяют токсинообразование микробов. В ряде случаев изучают и другие факторы вирулентности. Вышеперечисленные исследования, которые проводятся в бактериологической лаборатории, позволяют определить род или вид возбудителя.

В том числе для обнаружения источника инфекции, с целью выявления эпидемической цепочки заболевания, осуществляют внутривидовую идентификацию бактерий. Суть внутривидовой идентификации бактерий заключается в определении фаговара или фаготипа, изучении различных свойств выделенных антигенных бактерий. Процесс определения фаготипа называют фаготипирование. Фаготипирование осуществляют при брюшном тифе, стафилококковой инфекции, паратифе В.

На чашку с питательной средой, которая засеяна с помощью шпателя выделенной чистой культурой, наносят различные диагностические фаги по капле. В случае, если культура чувствительна к данному фагу, в результате бактериологического исследования наблюдаются так называемые негативные колонии (бляшки), которые выглядят как образования округлой формы участков разрушенных бактерий. Культура возбудителя может быть чувствительна к нескольким или одному фагам.

В связи с широким распространением лекарственно-устойчивых форм бактерий, для назначения рациональной химиотерапии необходимо определение антибиотикограммы — устойчивости или чувствительности к химиотерапевтическим препаратам выделенной чистой культуры возбудителя. Для антибиотикограммы используют либо метод бумажных дисков, либо наиболее точный, но громоздкий метод серийных разведений.

Метод бумажных дисков базируется на выявлении зоны подавления размножения бактерий вокруг дисков, которые пропитаны антибиотиками. В случае применения метода серийных разведений химический препарат — антибиотик с жидкой питательной средой разводят в пробирках, после чего засеивают в пробирки одинаковое количество бактерий. По отсутствию или наличию роста бактерий проводят учет результатов. В результате бактериологического метода исследования для определения идентичности штаммов, полученная антибиотикограмма может служить и эпидемиологическим целям.

Могут проводиться повторные исследования при выявлении бактерионосительства т. к. можно не обнаружить возбудителя в одной порции материала.

В настоящее время в современном мире существуют ускоренные методы определения вида и рода бактерий. Так, в России применяют систему индикаторных бумажек — СИБ, позволяющую через 6-12 часов и без использования большого числа питательных сред выделить чистую бактериальную культуру. Также широко используют иммунофлюоресцентный метод для экспресс-диагностики инфекционных болезней

Бактериологическое исследование — исследование, предназначенное для выделениябактерий и изучения их свойств с целью постановки микробиологического диагноза. 
Исследуемый материал следует брать  в  асептических  условиях в стерильную посуду и доставлять в лабораторию возможно скорее. В случае необходимости пробы следует хранить на холоде. Методика взятия проб зависит от объекта, характера заболевания и свойств микроорганизма. Одним из распространенных приемов бактериологического исследования является бактериоскопия. 
Для изучения нефиксированных бактерий пользуются двумя методами: раздавленной (между предметным и покровным стеклами) капли и висячей капли. Следует помнить, что препараты нефиксированных бактерий заразны. 
Для бактериоскопии фиксированных препаратов используют мазки. Для их приготовления каплю исследуемой жидкости распределяют по поверхности предметного стекла, а затем высушивают. Наиболее распространенным методом фиксации препарата является пронесение его через пламя газовой горелки. В некоторых случаях используют фиксирующие составы. Фиксированные препараты, как правило, окрашивают (см. Окраска микроорганизмов). К числу важнейших элементов бактериологического исследования относятся посевы и пересевыбактериальных культур, производимые бактериальной петлей или пастеровской пипеткой. Петлю стерилизуют прокаливанием в пламени, затем ее остужают прикосновением к участку незасеянного агара или ополаскивая в стерильной жидкости. При использовании пастеровской пипетки ее кончик обламывают пинцетом, несколько раз проносят пипетку через пламя горелки и дают остыть. При посевах используют жидкие и твердые питательные среды. При посеве на скошенный агар культуру бактерий растирают петлей по поверхности агара. При посеве в толщу агарового или желатинового столбика питательную среду прокалывают до дна пробирки петлей или особой иглой. При посеве в жидкую среду надо следить, чтобы жидкость не выливалась и не смачивала края пробирок и пробки. Посевы и пересевы следует проводить вблизи пламени газовой горелки, пробирки не должны долго оставаться открытыми, петля или пастеровская пипетка с культурой не должна ни к чему прикасаться; перед тем как закрывать пробирку, края ее следует прожечь. Засеянные пробирки необходимо тотчас же надписать. 
Важнейшим этапом бактериологического исследования является идентификация — определение видовой или типовой принадлежности бактерий, полученных в виде чистой культуры. При идентификации бактерий производится изучение их физиологических и биохимических свойств, токсинообразования. Широко используют серологические методы идентификации   бактерий   (реакции агглютинации ипреципитации). Во многих случаях эффективным оказывается биологический метод идентификации микроорганизмов, основанный на заражении лабораторных животных исследуемым материалом или полученной культурой бактерий и выявлении у животных характерных патологических изменений. 
Для выделения чистых культур используют механические и биологические методы. Пример механического метода: каплю исследуемого материала растирают одним и тем же стерильным шпателем или бактериальной петлей по поверхности плотной питательной среды, последовательно в первой, второй и третьей чашках Петри. Выделение чистой культуры производится из выросших отдельных колоний и заключается в их исследовании и отсеве на свежую питательную среду. Биологические методы выделения чистых культур основаны на учете того или иного свойства выделяемого микроба, отличающего его от других микробов, находящихся в исследуемом материале. 
При биологическом методе используют такого рода питательные среды, в которых созданы условия, благоприятные для развития определенного вида микробов. К числу биологических методов относится также заражение лабораторных животных, чувствительных к выделяемому виду бактерий. 
Выращивание бактерий производят в термостатах, в которых поддерживается постоянная температура, обычно 37°. В большинстве случаев выращивание продолжают около суток, но в зависимости от вида бактерий бывают необходимы и другие сроки выращивания. Разные виды бактерий нуждаются при выращивании в разных количествах кислорода. Для поддержания необходимой концентрации кислорода в среде пользуются разнообразными методами аэрации. См. такжеПитательные среды.

Бактериологическое исследование — комплекс методов для выявления патогенных микроорганизмов у больного, у носителя или на объектах внешней среды. Бактериологические исследования пользуются также для обнаружения условно патогенных и санитарно-показательных микробов, характеризующих степень загрязнения внешней среды, для изучения микробного пейзажа определенной среды (объекта). Бактериологическое исследование может быть использовано для диагностики, профилактики инфекционных заболеваний, для сан.-гиг. характеристики среды, окружающей человека, для научного исследования. 
Материал и метод бактериологического исследования зависят от цели анализа, условий среды, патогенеза и течения заболевания. При наличии бактериемии микроб обнаруживают при помощи посева крови. В случаях выраженных местных поражений возбудителя следует искать в отделяемом или выделениях пораженного органа (дифтерия, дизентерия, гонорея и др.). Наконец, при заболеваниях со сложным течением, когда (как, например, при брюшном тифе) бактериемия сменяется поражениями тонких кишок, на каждом этапе применяют соответствующий метод исследования: в течение первой недели заболевания производят посев крови, на второй наиболее достоверно серологическое исследование, начиная с третьей недели положительный результат получают при посеве испражнений; последним методом пользуются и в качестве контрольного исследования для обнаружения бактерионосителей среди реконвалесцентов и для наблюдения за ними. 
Выполнение любой из указанных задач осуществляют применением методов, предназначенных для выделения и определения микроорганизмов. В зависимости от 
характеристики микроба используют весь комплекс методов или его части. 
Бактериоскопия — наиболее достунный прием, основанный на микроскопическом изучении материала. При микроскопии свежих препаратов можно пользоваться некоторыми микрохимическими реакциями (например, окраска йодофильных бактерий раствором Люголя) или избирательной окраской разных структурных частей бактерий. 
Более четко бактерии можно выявить в окрашенном препарате. Исследуемый материал наносят на предметное стекло тонким и по возможности ровным слоем. Дают препарату высохнуть на воздухе и фиксируют одним из общепринятых методов, но чаще всего фламбированием, т. е. двух-, трехкратным быстрым проведением препарата над пламенем горелки так, чтобы стекло было теплое, но не горячее. Препарат, остуженный после фиксации, окрашивают простой или дифференциальной окраской (см. Окраска микроорганизмов). При флюоресцентной микроскопии используют как нативные, так и сухие препараты. В этом случае обработка определенными красителями вызывает свечение структур микробного тела или всего микроба в ультрафиолетовых или коротких синих лучах. В другой модификации микробов обрабатывают специфическими сыворотками, меченными флюоресцентами (красителями). Бактерии, соответствующие сыворотке, будут светиться, так как на них осядет меченая сыворотка. Гетерологичные бактерии не будут светиться.