Неинструментальные иммунодиагностические системы на основе углеродных наночастиц

2. Получение  стабильных конъюгатов на основе  углеродных наночастиц дает возможность  конструировать широкий спектр  систем анализа, как с высокой  степенью  универсальности, так  и с узко направленными задачами  определения конкретных лигандов, отвечающих основным требованиям,  предъявляемым к диагностическим системам: высокие чувствительность и специфичность, воспроизводимость, надежность, простота, оперативность.

3. Использование  в конструкции аналитических  систем уникальных свойств биотин-стрептавидинового  взаимодействия приводит к существенному  усилению чувствительности определения  при создании широкого спектра  диагностических тест-систем на  основе наночастиц углерода.

Связь работы с крупными программами. Работа проводилась в течение 1991-2007 гг. в соответствии с планом НИР ИЭГМ УрО РАН (номер госрегистрации темы НИР 01.9.00.017989), а также в рамках федеральной программы «Старт 05».

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на LXII сессии общего собрания Академии медицинских наук СССР, Москва, 1991, на Международном симпозиуме «Проблемы загрязнения окружающей среды, токсикология», Пермь-Москва, 1991, на Всероссийской конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной иммунологии», Пермь, 1994, на Международном симпозиуме «Загрязнение окружающей среды, токсикология и эпидемиология», Москва-Пермь, 1993, на Международной конференции по иммунореабилитации, Сочи, 1994, на Международном симпозиуме ICACI XV-EAACI'94, Стокгольм, Швеция, 1994, на Международной конференции по нейроиммунным взаимодействиям и загрязнению окружающей среды (ICONE’95), Санкт-Петербург, 1995, на XIII-м Ленсфилдском международном симпозиуме по стрептококку и стрептококковым заболеваниям, Париж, Франция, 1996, на Выставке достижений Российской биотехнологии, Берлин, Германия, 1996, на 4-м Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарства», Москва, 1997, на Международной конференции AAAAI/AAI/CIS, Сан-Франциско, США, 1997, на Конгрессе FASEB, США, 1998, на Международной конференции по загрязнению окружающей среды (ICEP’98), Москва, 1998, на Ежегодном собрании профессиональных ученых, Экспериментальная биология 98, Сан-Франциско, Калифорния, США, 1998, на Международном семинаре «Научно-технический потенциал Западного Урала в конверсии военно-промышленного комплекса», ISTC, Perm, Russia, 2001, на I-II конференциях иммунологов Урала, Екатеринбург, 2001, Пермь, 2002, на Всероссийском съезде иммунологов России, Екатеринбург, Россия, 2004, на IX Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге. Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии», 2005, на Всероссийском научном симпозиуме «Цитокины, стволовая клетка, иммунитет», Новосибирск, 2005, на IV, V и VI конференциях иммунологов Урала, Уфа, 2005, Оренбург, 2006, Ижевск, 2007, на Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия», Курск, Россия, 2006,  на 2-й Республиканской конференции «Иммунология репродукции: теоретические и клинические аспекты», Сочи, 2007.

Публикации. Материалы диссертации обобщены в 64 печатных работах, из них: 13 статей, включая 5 статей в журналах по перечню ВАК Минобрнауки РФ, 4 патента РФ на изобретение и 3 положительных решения о выдаче патентов РФ.

Объем и структура работы.  Работа изложена на 217 страницах, содержит 8 таблиц и 36 рисунков, состоит из введения, литературного обзора, материалов и методов, 4 глав собственных исследований, обсуждения и выводов. Список литературы включает 419 источников, в том числе: 50 на русском и 369 на английском языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Материалы. Растворы всех использованных в работе реагентов готовились на деионизированной воде с сопротивлением не менее 18 Мом. Были использованы реагенты: хлорид натрия, гидрофосфат натрия, дигидрофосфат натрия, бычий сывороточный альбумин, азид натрия, додецилсульфат натрия, карбонат и бикарбонат натрия, сахароза производства фирмы Sigma (США); углерод, полученный по собственной технологии; толуол, гептан, гексан, диметилформамид производства Реахим (Россия), 4-Cl-1-нафтол фирмы Sigma (США); Твин-20 производства фирмы Ferak (ФРГ); хорионический гонадотропин человека (ХГЧ), моноклональные антитела AB 0422 клона 1058 против β-субъединицы ХГЧ, моноклональные антитела AB 0420 клона 1001 против α-субъединицы ХГЧ, антитела к стрептококку группы А (СГА), конъюгат козлиных антител к стрептококку гр. А с HRP производства фирмы Binax (США); антистрептококковая кроличья референс-сыворотка фирмы Wellcome (Великобритания); группоспецифическая лиофилизированная ослиная антистрептококковая сыворотка НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, кроличья антистрептококковая сыворотка, литический комплекс из Streptomyces levoris 96, культура клеток стрептококка гр. А штамма № 6/49 типа М29 Пражской коллекции культур были получены в лаборатории стрептококковых инфекций ММА им. И.М.Сеченова, группоспецифический полисахарид стрептококка группы А, конъюгированный с бычьим сывороточным альбумином (АПСХ-БСА) был любезно предоставлен научным сотрудником НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи к.х.н. В.А.Кульшиным, сефароза 6В-CL производства фирмы Pharmacia Fine Chemicals (Швеция); рекомбинантный белок G (Protein G from Streptococcus sp. Recombinant) фирмы Sigma (США); стандартные панели сывороток, содержащих антитела к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ-1) в низких концентрациях серий 006, 007 и 008 и стандартная панель сывороток, не содержащих антитела к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) серии 004 производства НПО "Вектор" (Россия); антиботулинические и антистолбнячные антитела были выделены из коммерческих препаратов специфических антисывороток; ботулинический и столбнячный анатоксины получены из ГИСКа им. Л.А.Тарасевича; альфа-фетопротеин (АФП) и поликлональные антитела к АФП получены в ходе выполнения совместной работы с Институтом новых медицинских технологий, г. Краснокамск (ген. директор К.Ю. Новиков), моноклональные антитела к трофобластическому β-1-гликопротеину (ТБГ) и ТБГ получены самостоятельно; стрептавидин, стрептавидин, меченый пероксидазой хрена, N-гидроксисукцинимидный эфир аминокапроидбиотина производства ИЦПП "Пептос" (Россия); рекомбинантные полипептиды, продукты генов "envI", "envII", "gagI", "polI", контрольные сыворотки, содержащие антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2, контрольная сыворотка крови человека, не содержащая антитела к ВИЧ производства БТК "Биосервис" (Россия), IgG человека, кролика, мыши, антитела овцы против IgG кролика, антитела кролика против  IgG человека производства Sigma (США).

В качестве основы для конструирования твердофазных реагентов использовали различные  полимерные материалы: непористые, изготовленные  из полистирола, пористые – из нитроцеллюлозы. В частности: планшеты для серийных разведений из белого полистирола производства фирмы Linbro (США); нитроцеллюлозные мембраны 0,45 мкм BA-85, 5,0 мкм AE-98 производства фирмы Schleicher & Schuell (ФРГ), LC 5 мкм и 10 мкм производства Millipore (США), Trans-Blot Transfer Medium, Pure Nitrocellulose Membrane 0,45 мкм, Био-Рад (США); диализные мешки Visking Dialysis Tubing производства фирмы Serva (Германия).  

В работе использовали следующие буферные растворы:

1. 0,15 М  раствор NaCl, забуференный 0,015М Na-фосфатами, pH 7,25 (ЗФР);

2. ЗФР  с 0,05% Твина 20 (ЗФРТ);

3. 0,02 М  комплексирующий карбонатно-бикарбонатный  буфер, pH 9,6 (КББ);

4. 0,1 М  карбонатно-бикарбонатный буфер, pH 8,6.

5. Блокирующий  раствор – ЗФРТ, содержащий 1% казеина  (ЗФРТ-К) 

Методы

1. Биотинилирование антител  проводили по Goding J.W. [1980].

 К  0,9 мл раствора антител в концентрации 1 мг/мл, предварительно отдиализованного в течение 12 часов против 0,1 М карбонатно-бикарбонатного буфера pH 8,6, добавляли 0,1 мл ДМСО, содержащего 0,1 мг N-гидроксисукцинимидного эфира аминокапроидбиотина. После четырех часов инкубации при комнатной температуре диализовали против ЗФР, содержащего 0,1% азида натрия, с целью удаления несвязавшегося эфира биотина при +4^оС в течение 12-14 часов.

Биотинилирование  БСА проводили по аналогичной  схеме.

2. Проявление  пероксидазы в дот-ELISA проводили  с использованием субстратной смеси следующего состава:

3,5 мл 0,05 М Трис-НCl с 0,15 М NaCl pH 7,5;

1,5 мл 4-Cl-1-нафтол (10 мг/мл этилового спирта);

16 мкл  3% перекись водорода.

3. Ферментную  детекцию при определении антител  к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 проводили реагентами  из набора "Блот-ВИЧ" БТК  "Биосервис" (Россия) по инструкции  производителя.

4. Концентрирование  проводили в диализных мешках  в сухом Фиколле 400 производства  Serva (Германия).

5. Определение  белка проводили по Bradford M.M. [1976].

6. Гетерогенность  реагентов оценивали электрофоретически  в ПААГ  [Laemmly V.K., 1970]  и по результатам HPLC на хроматографе Hitachi JC 400 с колонкой TSK G2000SW (Япония) по рекомендации производителя.

7. Очистку  иммуноглобулинов осуществляли  гель-хроматографией на колонке  2,6 см х 80 см (LKB, Швеция). В качестве  носителя использовали Сефакрил S-300 Pharmacia Fine Chemicals (Швеция).

8. Ультразвуковую  дезинтеграцию частиц углерода  производили на дезинтеграторе  УЗДН-2М (Россия) при частоте 22 кГц.    

9. АФП  получали из абортной крови  по оригинальной технологии. Для  этого кровь центрифугировали  в течение 1 часа при 6000 g и наносили на сорбент: поликлональные антитела к АФП человека/сефароза. После нанесения и отмывки сорбента белок элюировали 0,1 М глицин-HCl буфером с рН 2,5 - 2,6, диализовали против физраствора и проводили негативную хроматографию на сорбенте поликлональные антитела к IgG человека/сефароза 4В с целью извлечения примесных иммуноглобулинов. Полученный препарат был электрофоретически гомогенен.

10. Поликлональные  антитела получали иммунизацией  коз (возраст 2-8 лет, масса 30-35 кг) препаратом АФП. Первичную  иммунизацию проводили раствором  АФП с полным адъювантом Фрейнда  из расчета 0,3 мг/кг массы тела  животного инъекцией в предлопаточный  лимфатический узел и подкожно  в область холки. Повторную  иммунизацию проводили через  три недели чистым АФП, который  вводили внутривенно, подкожно  и внутримышечно. Забор крови  проводили через 4 недели.

Выделение антител из крови осуществляли аффинной хроматографией, которую проводили  после центрифугирования и сульфатаммонийного фракционирования сыворотки крови  иммунизированного животного. Фракцию, содержащую иммуноглобулины, наносили на сорбент АФП/сефароза CL-6B. После  отмывки колонки антитела элюировали 0,1 М глицин-НCl буфером рН - 2,55, диализовали  против забуференного физраствора  и концентрировали до 10 мг/мл.

11. Моноклональные  антитела к ТБГ получали из  культуральной среды гибридомы  BAP3 (лаборатория клеточных культур,  зав. лаб. Орит Лейтер, центр  биологических исследований Вейцмана, Израиль). Для этого среду, содержащую антитела, наносили на сорбент белок G/сефароза FF. После отмывки сорбента антитела элюировали 0,1 М глицин-HCl буфером (рН 2,6) и диализовали против ЗФР. 

12. ТБГ  получали из сыворотки крови  беременных женщин на сроках  беременности свыше 37 недель по  оригинальной технологии. Для этого  сыворотку крови, предварительно  фракционированную сульфатом аммония,  наносили на сорбент моноклональные  антитела к ТБГ/сефароза CL-4B. Элюцию  проводили как описано выше. Полученный  препарат после диализа доочищали  на колонке с противовидовыми  анти-лигандами. 

13. Сорбент  моноклональные антитела к ТБГ/сефароза CL-4B получали конъюгацией полученных  антител с бромцианактивированной  сефарозой CL-4B по методике производителя  (Pharmacia Fine Chemicals, Швеция).

14. Детектирующие  реагенты, полученные и использованные  в работе представлены в таблице  1.

15. Объекты  исследования и число проведенных  определений представлены в таблице  2.