Неинструментальные иммунодиагностические системы на основе углеродных наночастиц

 

Технологическое решение задачи разработки метода одноэтапного конъюгирования аффинных соединений с  углеродной меткой.

 

В качестве источника частиц углерода использовали аморфный углерод, который получали в виде сажи путем конденсирования  из пламени горящего толуола на стеклянной поверхности. Собранный материал подвергали тщательной отмывке комплексом органических растворителей до исчерпывающего удаления продуктов неполного окисления  углеводорода. Углерод суспендировали в 10-ти кратном по весу количестве толуола  и кипятили  в колбе с обратным холодильником в течение 30 минут, остужали, отфильтровывали на фильтре  Шотта. Далее процедуру повторяли 5 раз без нагревания до полного исчезновения окраски в растворителе, после чего отфильтрованный углерод пятикратно отмывали при  комнатной температуре диметилформамидом и гексаном. Подобная процедура приводила к полному обесцвечиванию протекающего через очищаемый углерод растворителя каждого вида. Выбор используемых растворителей осуществляли на основании экспериментальных данных, сравнивая эффективность отмывки отдельных проб различными реагентами. Посредством высушивания под вакуумом конечный продукт освобождали от следов связанных органических растворителей и дополнительно прокаливали до постоянного веса в сухожаровом шкафу при 200-300^оС в течение 12-24 часов. Получаемый подобным способом чистый аморфный углерод представлял собой матово-черный лиофильный порошок, нерастворимый в доступных известных растворителях.

В процессе получения суспензии углеродных частиц к 2-х процентному раствору белка G в ЗФР добавляли аморфный углерод до конечной концентрации 5% в условиях вихревого перемешивания  на магнитной мешалке. Использовали магнитный перемешивающий элемент, выполненный в виде «турбинки», что  обеспечивало дополнительную гомогенизацию  получаемой суспензии. Время, необходимое  для полной пептизации частиц при  комнатной температуре, составляло 30-36 часов. Полученную суспензию озвучивали в ультразвуковом дезинтеграторе. Условия  ультразвуковой обработки суспензии (частота и мощность, количество и продолжительность циклов озвучивания) подбирали таким образом, чтобы обрабатываемый материал при одновременном (возможном) охлаждении не разогревался до температуры свыше 40^оС. Полученный в результате эффективной ультразвуковой дезинтеграции суспензоид центрифугировали при 6000 g в течение 5-ти минут с целью удаления оставшихся относительно крупных частиц. В суспензию пептизированных белком G частиц углерода на роторном встряхивателе вносили равный объем 25% глутарового альдегида. Процесс конъюгирования проводили в течение 1 часа 40 минут при комнатной температуре и интенсивном перемешивании, после чего реагент центрифугировали при 6000 g и освобождали от избытка глутарового альдегида и несвязавшегося анти-лиганда гель-фильтрацией на колонке с Сефарозой CL-6B.

 Фракции,  вышедшие в холостом объеме  и содержащие конъюгат, объединяли  и добавляли БСА и глицерин  до конечных концентраций, соответственно 1% и 20%. В качестве консерванта во всех растворах присутствовал азид натрия в конечной концентрации 0,1%.

Конъюгаты углеродных частиц со стрептавидином получали аналогичным способом.

Синтезы углеродных конъюгатов, аффинными соединениями которых являлись антитела к ХГЧ, стрептококку группы А и АФП, включали предварительную процедуру дополнительной очистки «пришиваемых» анти-лигандов гель-хроматографией на Сефакриле S-300, после чего схема синтеза, в том  числе антител к ТБГ в качестве «пришиваемого» анти-лиганда, не отличалась от описанной выше. Условная схема  получаемой в результате частицы  представлена на рис.1.

Углеродная  частица

Анти-лиганд

Глутаровый альдегид

Анти-лиганд

Рис. 1. Условная схема частицы, полученной в результате

одноэтапного синтеза

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Таким образом, результатом разработки одноэтапной  технологии синтеза углеродных конъюгатов явились, как минимум, два обстоятельства. С одной стороны, произошло существенное упрощение технологического процесса, которое привело к сокращению не менее, чем в два раза времени  синтеза диагностических реагентов, существенному снижению трудоемкости и затратности их получения. С  другой, – использование аффинного  соединения в качестве пептизирующего полимера неизбежно приводит к увеличению удельного количества его эффекторных  групп, связываемых с меткой, следствием чего можно ожидать повышение  чувствительности определения лигандов  в сконструированных системах аналитического тестирования. Разработанная технология была воспроизведена в 54-х синтезах различных конъюгатов. Схемы синтезов представлены на рис. 2.

Рис. 2. Схемы двухэтапного (А) и одноэтапного (Б) синтезов углеродных диагностикумов

Цифрами обозначены номера этапов

Центрифугирование

 

Хроматография

 

Концентрирование

Конъюгирование

 

Центрифугирование

 

Хроматография

 

Пептизация  инертным белком

 

Озвучивание

 

Активация

А

Пептизация  аффинным соединением

 

Озвучивание

 

Активация + Конъюгирование

Центрифугирование

 

Хроматография

Б

1

1

2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Проведенные эксперименты показали, что длина  волны спектрофотометра, равная 450 нм, при измерении OD углеродного суспензоида  наиболее демонстративна с точки  зрения удобства формализации оптической оценки реагента. Рабочая концентрация конъюгата составила 0,03%. Определяя  оптическую плотность получаемого  реагента, вычисляли титр (рабочее  разведение), при котором использовали диагностикум в системах анализа.

Рис. 3. Оценка эффективности  детекции в ходе определения биотинилированного БСА углеродными конъюгатами  на основе стрептавидина 

А – конъюгат, синтезированный  по одноэтапной схеме ex tempore.

Б - конъюгат, хранящийся при температуре +4^оС - +8^оС в течение 10-ти лет.

В - конъюгат, хранящийся при температуре +4^оС - +8^оС в течение 10-ти лет,  с периодической экспозицией в течение 2-х недель при  +22^оС.

Стабильность  получаемых реагентов изучали на примере конъюгата стрептавидин-углерод, синтезированного по одноэтапной схеме  в 1997 году. Его хранение осуществляли в бытовом холодильнике (температура  от +4^оС до +8^оС) в герметично закрывающемся стеклянном флаконе. В процессе хранения часть образцов диагностикумов помещали на две недели в условия комнатной температуры (+22^оС)  с усредненной периодичностью один раз в два месяца. Аналитическую эффективность детекции оценивали по определению биотинилированного БСА, нанесенного на нитроцеллюлозную мембрану 0,45 мкм из разведений кратных десяти. Параллельно  осуществляли детекцию конъюгатом, синтезированным ex tempore. Результаты сравнительного анализа представлены на рис. 3.

Как показывают результаты исследования, десятилетний срок хранения детектирующих реагентов  при температурах бытового холодильника не оказывает заметного влияния  на эффективность системы аналитического определения соответствующих лигандов даже при условиях кратковременного отклонения от оптимального режима. Чувствительность определения во всех вариантах составила 10 нг/мл.

 

Универсальность, как основной принцип  детекции в структуре серологического  анализа, сконструированного на основе углеродного конъюгата с G белком.

 

В первую очередь, важен тот факт, что G белок, выделенный в свое время из стрептококка G148, обладает чрезвычайно ярко выраженным сродством к Fc-фрагментам молекул IgG большинства млекопитающих, вовлеченных, так или иначе, в научно-исследовательскую сферу деятельности человека. Это послужило основанием для создания ряда аффинных сорбентов для специфического выделения и очистки иммуноглобулинов класса G, что нашло свое отражение в очистке антител, как одной из стадий реализации гибридомной технологии. Однако было бы совершенно неоправданно пройти мимо описанных свойств G белка, имея ввиду их использование в диагностике. Особенно важно подчеркнуть, что для самого G белка не играет никакой роли ни видовая принадлежность, ни способ получения, ни источник связываемых иммуноглобулинов.

Прямое определение IgG. На нитроцеллюлозную мембрану с размером пор 0,45 мкм при помощи приспособления «BIO-DOT Apparatus» (BIO-RAD, США) наносили IgG человека, из серийных двукратных разведений. После подсушивания мембраны и 30-ти минутной инкубации в блокирующем растворе, в качестве которого использовали забуференный фосфатами физраствор, содержащий 0,05% Твина-20 и 1% казеина (ЗФРТ-К), мембрану инкубировали в течение 15 минут в растворе описываемого конъюгата. Параллельно осуществляли детекцию аналогичным конъюгатом, но полученным в результате двухэтапного синтеза. Результаты сравнительного определения, подтвержденные в ходе исследования аналитических параметров 13-ти конъюгатов G-белка с углеродными частицами, представлены на рис.4.

Рис. 4. Прямое определение IgG человека

1 - детекция конъюгатом G белка с  углеродом, полученным в результате  одноэтапного синтеза,

2 - детекция конъюгатом G белка с углеродом, полученным  в результате двухэтапного синтеза

Результаты  определения подтверждают предположение  о том, что технология одноэтапного синтеза углеродных конъюгатов приводит к повышению чувствительности систем детекции. Реальным объяснением полученного  эффекта может быть прогнозированное увеличение числа связывающих центров, включенных в активную поверхность  углеродных частиц, составляющих диагностический  реагент.

Определение антител к ВИЧ-1 и 2 в  варианте сэндвич-анализа. В качестве твердофазных реагентов для определения использовали нитроцеллюлозные полоски с нанесенными в виде поперечных линий анти-лигандами – рекомбинантными вирусоспецифическими белками, продуцируемыми генами envI, gagI, polI и envII; и контрольными антигенами – внутренний отрицательный контроль – рекомбинант, не содержащий антигенных детерминант к ВИЧ-1 и 2, и внутренний положительный контроль – сыворотка против IgG человека. В качестве исследуемых образцов использовали смесь сывороток больных СПИДом с верифицированной инфекцией ВИЧ-1 и ВИЧ-2, которую предварительно двукратно разводили в ЗФРТ-К, начиная с разведения 1/250. Готовые полоски (две серии по 11 полосок) помещали в исследуемые образцы и после 30-ти минутной инкубации промывали ЗФРТ трижды по 2 минуты. Детекцию проводили двумя диагностикумами: конъюгатом G белка с частицами углерода, полученным в результате одноэтапного синтеза, и ферментным конъюгатом (рис. 5).

Рис. 5.  Сравнительное определение  антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2

А -  детекция углеродным конъюгатом

Б - детекция ферментным конъюгатом

К- - отрицательный контроль (сыворотка, не содержащая антител к  ВИЧ-1,2)

1 - внутренний положительный  контроль

2 - внутренний отрицательный  контроль

3 - envII, 4 - polI, 5 - gagI, 6 - envI

  1  2      3  4  5  6

А

Б

Результаты  сравнительного определения наглядно демонстрируют преимущества неферментной детекции, чувствительность которой  в 4-8 раз превышает ферментную. Дело в том, что ферментная детекция предусматривает  реакцию, катализируемую пероксидазой хрена, в ходе которой преципитирующий  субстрат 4-Cl-1-нафтол приобретает синюю  окраску. Интенсивность окрашивания (цветность) продукта реакции значительно  уступает хромогенности частиц коллоидного  углерода, а это неизбежно сказывается  на чувствительности определения.

О высокой  чувствительности и специфичности  определения свидетельствует тот  факт, что в ходе детекции 202-х  ВИЧ-1-позитивных сывороток, 12-ти ВИЧ-2-позитивных сывороток, трех стандартных панелей  сывороток содержащих антитела к  ВИЧ-1 ГИСКа им. Л.А Тарасевича  и 114-ти ВИЧ-негативных сывороток, полученных из банка донорской крови, тринадцатью  конъюгатами G белка с частицами  углерода не было получено ни одного ложноотрицательного  или ложноположительного результата.

Рис.  6. Дот-иммуноаналитическое 

определение антистрептококковых 

антител

В крайней левой зоне каждой полоски – 

внутренний положительный  контроль

(IgG кролика), далее –  внутренний 

отрицательный контроль (БСА) и 

в центре – зоны определения. Справа

указаны концентрации антител  в

исследуемых пробах

Определение антител к  стрептококку группы А (СГА). В качестве иммуносорбентов использовали полоски нитроцеллюлозы с сорбированными на них в качестве анти-лиганда АПСХ-БСА из раствора с концентрацией 0,1 мг/мл ЗФР дотами по 3 мкл, кроличьими IgG (внутренний положительный контроль) и БСА (внутренний отрицательный контроль), нанесенными из раствора с концентрацией 0,1 мг/мл ЗФР. Подсушенные после нанесения анти-лигандов полоски блокировали в ЗФРТ-К в течение 30 минут при 37^оС, промывали в ЗФРТ и вновь высушивали. Полученные описанным способом твердофазные реагенты инкубировали в растворах с известной концентрацией антистрептококковых антител, разведенных с шагом 2 в ЗФРТ, начиная с 50 нг/мл, в течение 30 минут, после чего  осуществляли детекцию углеродным конъюгатом с G белком. Результаты анализа представлены на рис. 6.

Чувствительность  определения, как следует из результатов  анализа, составила 0,38 нг/мл. О высокой  специфичности системы анализа  свидетельствует отсутствие  как  ложноотрицательных (все точки положительного контроля визуализированы в ходе определения), так и отсутствие ложноположительных  (отсутствие связывания углеродного  конъюгата в зонах сорбции  БСА) результатов. Результаты определения  воспроизведены в ходе тестирования тринадцати синтезированных конъюгатов.