Неинструментальные иммунодиагностические системы на основе углеродных наночастиц

Из результатов  анализа следует, что получаемый препарат был контаминирован кроличьими антителами, что свидетельствует  об утечке лиганда с применяемой  на стадии доочистки аффинной колонки. Положительный и отрицательный  контроли убедительно продемонстрировали высокий уровень специфичности  системы анализа. Подобный пример может  служить демонстрацией универсальных  способностей сконструированной системы  детекции и прогнозировать возможность  формирования универсального набора для  конструирования систем анализа  в условиях любой исследовательской  лаборатории в зависимости от актуальных потребностей.

    Привлекательной стороной использования  особенностей биотин-стрептавидинового  взаимодействия явилась возможности  усиления чувствительности детекции. Идея использования амплификации  результирующего сигнала потребовала  синтеза углеродного конъюгата  с биотином в качестве аффинного  соединения. Для этого в качестве  исходного реагента использовали  биотинилированный БСА. Схема  одноэтапного синтеза ничем не  отличалась от описанной технологии  получения диагностикумов с G белком, стрептавидином, очищенными  поли- и моноклональными антителами.

Рис. 20. Сравнительная детекция биотинилированного БСА на непористой твердой фазе стрептавидиновым конъюгатом в стандартных условиях (Б) и в варианте усиления (А)

5        мкг/мл

5

20

Для реализации идеи усиления результирующего сигнала  на дно лунок полистирольного  планшета сорбировали описанным  способом биотинилированный БСА  дотами из капель по 5 мкл из разведений кратных двум в КББ, начиная с 5 мкг/мл. После комплексирования в  лунки вносили в одном случае конъюгат стрептавидин-углерод, в другом - смесь равных объемов конъюгатов стрептавидин-углерод и биотин-углерод (рис. 20).

Представленные  результаты подтверждают возможность  повышения чувствительности определения  с использованием приема усиления результирующего  сигнала введением в систему  детекции биотинилированного углерода. Чувствительность определения в  стандартных условиях составила 20 нг/мл, с усилением – 5 нг/мл. Механизм наблюдаемого усиления можно представить следующим  образом. Частицы углерода связываются  со специфическим иммунным комплексом на поверхности твердой фазы посредством  взаимодействия стрептавидина на их поверхности с биотинилированным  лигандом. В свою очередь, частицы  углерода, поверхность которых модифицирована биотином, связываются с уже иммобилизованными  частицами стрептавидинового диагностикума.

И те и  другие частицы доступны для продолжения  взаимных «контактов», осуществление  которых приводит к амплифицированному увеличению числа связанных углеродных частиц в зоне сорбции специфических  комплексов или молекул, что и  способствует усилению результирующего  сигнала. Кроме того, пространственная структура конъюгатов позволяет  связываться с сорбированным  на твердой фазе лигандом преформированного  комплекса, образующегося в жидкой фазе реакционного объема.  В сочетании  с использованием пористого материала  для сорбции анти-лигандов описанный  прием может существенно повысить чувствительность детекции. Данное предположение  было наглядно подтверждено в варианте определения анти-человеческих антител  при анализе кроличьей иммунной сыворотки  с целью оценки эффективности  сероконверсии. Для проведения анализа  поверхность нитроцеллюлозных полосок  сенсибилизировали иммуноглобулинами G человека.  Использовали уже описанное  приспособление «Био-Дот». В прибор устанавливали мембрану с диаметром  пор 0,45 мкм  и в 6 рядов лунок  вносили анти-лиганды по 20 мкл  из раствора с концентрацией 1 мг/мл ЗФР. В качестве внутреннего положительного контроля использовали биотинилированный  БСА, в качестве отрицательного –  интактный БСА. После полного  высушивания анти-лигандов полоски  блокировали описанным способом и вновь высушивали. Подготовленный подобным образом иммуносорбент  вновь помещали в прибор и вносили  в нечетные ряды лунок по 0,2 мл растворов  кроличьих антител против IgG человека с известной концентрацией от 50 мкг/мл до 5 пг/мл. В лунки четных рядов - образцы сыворотки иммунизированного кролика по 0,2 мл, разведенной в ЗФРТ с шагом 10. После полного прохождения образцов сквозь мембрану лунки промывали ЗФРТ 3-х кратно по 0,2 мл, после чего вносили в каждую лунку по 20 мкл биотинилированных анти-кроличьих антител в концентрации 1,0 мг/мл. В контрольные лунки вносили ЗФРТ. После двукратной промывки лунок ЗФРТ мембрану извлекали из прибора, вновь промывали и осуществляли детекцию в стандартной системе стрептавидиновым конъюгатом, описанной выше смесью конъюгатов стрептавидин-углерод и биотин-углерод и ферментным конъюгатом стрептавидин-пероксидаза хрена (рис.21).

Рис. 21. Сравнительное определение  кроличьих антител углеродными  конъюгатами в стандартных условиях (А), в варианте усиленной детекции (Б) и ферментным конъюгатом (В)

Левые ряды дотов на каждой полоске –  разведения анти-человеческих кро-личьих антител, правые – разведения сыворотки  кролика, иммунизированного человеческими  иммуноглобулинами 

Из  результатов проведенных сравнительных  анализов следует, что вариант совместного  использования углеродных конъюгатов на основе стрептавидина и биотина  позволяет существенно (в данном случае в 100 раз) повысить чувствительность определения.

Ферментная  детекция, чувствительность которой  равна чувствительности определения  стрептавидиновым конъюгатом в стандартных  условиях (без усиления), тем не менее, проигрывает по другим важным характеристикам. Прежде всего, обращает на себя внимание наличие слабого сигнала (фона) в  зоне отрицательного контроля.  Факт вполне объяснимый тем обстоятельством, что ферментная метка, особенно пероксидазная, обладает способностью к неспецифическому связыванию, как с белками, так  и с пористыми материалами  на основе нитроцеллюлозы. Дело в том, что общепринятая технология получения  пероксидазных конъюгатов [Tijssen, 1985]  предусматривает периодатное окисление фермента с последующим после конъюгирования восстановлением боргидридом натрия. Даже при самом незначительном от исчерпывающего отклонении в восстановлении окисленных форм фермента, что часто бывает в условиях масштабированного производства, появляются проблемы с фоном в ходе аналитических исследований.

Все описанные  выше системы аналитического определения  были либо направлены на детекцию иммунореактивных соединений, либо использовали иммунореактивные соединения в структуре аналитической  аранжировки. Однако, если иметь ввиду  более широкое понятие «стереоспецифический анализ», можно легко прогнозировать возможность разработки систем, основанных на принципах генно-гибридизационного  и лиганд-рецепторного взаимодействий, в которых также есть место  реализации достоинств углеродных конъюгатов.

ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенные исследования наглядно продемонстрировали возможность получения надежных диагностикумов, эксплуатирующих уникальные природные свойства углеродных частиц. Химически индифферентный материал может быть вовлечен в физико-химическую перестройку, результатом которой  является получение принципиально  нового продукта – конъюгата инертных в отношении образования прочных  химических связей углеродных частиц с различными биологически активными  молекулами. Высокий уровень оптической контрастности (хромогенности) обеспечивает углеродной метке приоритетное положение  в ряду любых цветных материалов, применяемых в диагностических  системах.     

Разработанная одноэтапная технологическая схема  синтеза углеродных конъюгатов, по существу, представляет собой простой  и надежный способ  масштабного  производства диагностикумов разной направленности. При этом, она объективно не зависит  ни от условий производства, ни от уникального  оборудования, требующего, как правило, дополнительных затрат на обслуживание и эксплуатацию. Смена производимого  продукта не влечет за собой никаких  технологических  изменений и  связанных с этим материальных затрат, а вопросы масштабирования решаются простым изменением объема сорбента, участвующего в процессе хроматографии.   

Представленные  результаты аналитического тестирования в полной мере демонстрируют основные привлекательные характеристики тест-систем, конструируемых с использованием углеродных конъюгатов. Высокая чувствительность за счет исключительной хромофорности  углеродных частиц и максимального  размещения активных групп на их поверхности  обеспечивают получение диагностически значимого результата. Высокая специфичность, подтвержденная отсутствием примеров неспецифического связывания, в основе которой лежат технологические  решения, предусматривающие минимизацию  неспецифических взаимодействий, отвергает  возможность получения ложноположительного  результата, который может стать  причиной негативных последствий некорректного  тестирования. Стабильность реагентов, обусловленная прочностью химических связей, что являющается следствием надежного конъюгирования аффинных соединений с частицами коллоидного  углерода,  обеспечивает не только хорошую  воспроизводимость результатов, но и возможность длительного и  нетребовательного хранения. Это  в равной степени касается и перспектив неограниченно долгого хранения результатов анализа, что бывает чрезвычайно важно в ситуациях, когда необходимо сравнение результатов  исследований, разнесенных во времени.

Не меньшее  значение имеет ряд процедурных  удобств, свойственных сконструированным  системам аналитического тестирования. Особенно это касается возможности  создания экспрессных тест-систем. Такое качество, как простота исполнения анализа, освобождает от необходимости  подготовки квалифицированных специалистов, что часто бывает серьезной проблемой  в условиях небольших отдаленных от крупных центров медицинских  пунктов и лабораторий. Наглядность  и очевидность полученных результатов  анализов предохраняют от неоднозначности  и субъективизма в их трактовке, а оперативность исполнения позволяет  сократить до минимума время адекватной реакции, особенно в случаях необходимости  экстренного принятия мер интенсивной  терапии. Все это может и должно стать основой для скорейшего доведения описанных и перспективных  моделей аналитических систем до готового к использованию состояния  и перехода к масштабному выпуску  диагностических тест-систем углеродного  происхождения.

Описанные конкретные системы аналитического определения различных лигандов никоим образом не исчерпывают возможности  применения, как разработанной технологии, так и спектра конструируемых на ее основе систем детекции. Все описанные  аналитические модели и различным  образом аранжированные форматные  процедуры определения принципиально  отличающихся лигандов служат лишь демонстрацией  некоторых возможностей применения детектирующих реагентов, синтезированных  на основе частиц углерода. Более того, представленные примеры и те, которые  представляют собой лабораторные модели, и те, которые используются в реальной лабораторной аналитической практике (идентификация IgG, оценка уровня сероконверсии), могут быть отнесены к группе, так  называемых, неинструментальных методов  исследования. Но неинструментальность не является основной целью представляемого  направления научных исследований, а потому, не ставится автором в  ряд необходимых процедурных  характеристик, оценивающих основные параметры сконструированных тест-систем с позиции их привлекательности. Есть все основания, в том числе  и экспериментальные, полагать, что  описанные диагностические реагенты могут быть с успехом использованы в разработке инструментально аранжированных методов, в частности, турбидиметрического  анализа с использованием спектрофотометрии  для формализации получаемых результатов  и плашечного варианта твердофазного  анализа с детекцией результатов  в планшетном фотометре. Очевидно, что  это позволит существенно модифицировать целый ряд диагностических методов  исследования, находящихся в арсенале клинических лабораторий, но это  уже цель будущих исследований. 

Необходимо  отметить, что не все представленные аранжировки аналитических систем являются совершенными и технологичными. Нельзя, например, надеяться на то, что  в любой лаборатории найдется прибор «Био-Дот» для нанесения образцов на мембрану и осуществления анализа. Отсюда - необходимость в дальнейшей разработке различных форматных  аранжировок и процедурных приемов, основанных на использовании описанных  свойств углеродных конъюгатов.    

Таким образом, разработанная технология синтеза  конъюгатов углеродных наночастиц может  стать основой для конструирования  широкого спектра эффективных систем для упрощенного диагностического тестирования, способных существенно расширить диапазон и повысить уровень информативной ценности и надежности фундаментальных и прикладных аналитических исследований в биологии, медицине, криминологии, сельском хозяйстве и т.д. Привлекательные характеристики таких тест-систем с успехом могут быть реализованы в разнообразных  "один пациент-один тест" наборах для амбулаторных, пребольничных и больничных анализов, включая срочные клинические и эпидемические ситуации, в массовых "домашних" системах, пригодных для индивидуального использования, в полевых условиях работы экспедиционных групп и службы воинских подразделений, в экстренных ситуациях работы бригад скорой помощи и отрядов МЧС. Ими могут быть укомплектованы все ветеринарные службы: от клинических ветлабораторий до сельских ветпунктов, мобильные аптечки, необходимые в повседневной практике сельскохозяйственного производства. Главное преимущество разработанной технологии, заключается в ковалентном механизме конъюгирования биореагентов и углеродных частиц, что способно обеспечить перспективу разработки и широкое внедрение диагностикумов, сконструированных на ее основе.

ВЫВОДЫ:

1. Разработана  одноэтапная технология синтеза  белково-углеродных конъюгатов, предусматривающая  гидрофилизирующую пептизацию углеродных  наночастиц аффинным соединением,  активацию гомобифункциональным  реагентом и конъюгирование, осуществляемые  единовременно. Эффективность разработанной  технологии воспроизведена в  54-х синтезах.

2. Получаемые  конъюгаты могут сохранять свои  аналитические и эксплуатационные  свойства в условиях хранения  при +4^оС - +8^оС в течение 10-ти лет. Кратковременные (2 недели) отклонения в сторону повышения температуры хранения до +22^оС не вызывают негативного влияния на свойства диагностикумов.

3. Обоснована  универсальная система определения  иммуноглобулинов класса G человека  и животных, позволяющая с высокой  чувствительностью и специфичностью  определять любые лиганды, обладающие  сродством к G белку стрептококка, использованного в качестве аффинного  соединения диагностикума.