Неинструментальные иммунодиагностические системы на основе углеродных наночастиц

 

Универсальный набор для определения IgG. Проведенные исследования позволили разработать универсальный набор, предназначенный для самостоятельного конструирования в условиях научно-исследовательских лабораторий необходимые тест-системы, способные определять любые IgG в зависимости от интересов и потребностей исследователей. В состав набора входят:

1. Конъюгат G белка с частицами коллоидного углерода.
2. 10-ти кратный концентрат ЗФРТ-К.
3. Полоски нитроцеллюлозы с отмеченными зонами нанесения анти-лигандов и нанесенными IgG кролика (в качестве внутреннего положительного контроля) и БСА (в качестве внутреннего отрицательного контроля).

Инструкция  по применению сводится к рекомендации нанести соответствующий антиген  из раствора с концентрацией 10-100 мкг/мл каплей объемом 3-5 мкл в отмеченную на полоске зону, подсушить в течение 15-20 минут и выдержать 30 минут  в разведенном предварительно ЗФРТ-К. Полученные таким образом иммуносорбенты проинкубировать в течение 30 – 60 минут в исследуемой пробе  и после 3-х кратной промывки в  ЗФРТ осуществить детекцию, выдержав полоски в течение 15 минут в  растворе конъюгата. Можно самостоятельно сконструировать практически любую  тест-систему определения антител, относящихся к иммуноглобулинам класса G при условии наличия соответствующих  антигенов. Но даже при отсутствии соответствующих  антигенов, образцы можно напрямую сорбировать на нитроцеллюлозные полоски  и осуществлять детекцию описанным  способом, учитывая, что детекции будут  подвергнуты все IgG, находящиеся  в исследуемой пробе. Таким образом, конъюгат G белка стрептококка с  наночастицами коллоидного углерода представляет собой универсальный  инструмент, применение которого для  прямой визуализации (детекции) специфических  лигандов и взаимодействий с участием иммуноглобулинов G отвечает всем требованиям  корректной диагностики, реализуя основные качественные характеристики: чувствительность, специфичность, воспроизводимость, надежность, наглядность, доступность, безопасность и др.

Иммуноаналитические системы определения хорионического гонадотропина человека (ХГЧ)

 

Иммунохроматографическое определение  ХГЧ. Для конструирования систем иммунохроматографического определения ХГЧ  в качестве детектирующего реагента использовали конъюгат углеродных частиц с моноклональными антителами к  β-субъединице гормона. На твердой фазе, в качестве которой применяли нитроцеллюлозные пластинки размером 20х80 мм с диаметром пор 5,0 мкм, сорбировали в виде поперечных линий моноклональные антитела к  α-субъединице гормона из раствора с концентрацией 1,0 мг/мл ЗФР и сам гормон в качестве внутреннего положительного контроля в концентрации 50000 МЕ/л.  После полного высыхания нанесенных анти-лигандов пластинки блокировали в растворе ЗФРТ-К в течение 30 минут и подсушивали при 37^оС, промывали ЗФРТ и вновь высушивали. Подготовленные подобным образом иммуносорбенты наклеивали на прозрачный поливинилхлоридный толстый скотч. Верхнюю границу такой пластинки при помощи того же скотча плотно соединяли с впитывающим элементом (полоска толстой крупнопористой целлюлозной фильтровальной бумаги размером 40х80 мм), нижнюю – с таким же элементом, но размерами 10х80 мм, в качестве нижней контактной зоны. Полученную конструкцию нарезали на полоски шириной 4 мм.

В роли исследуемого образца использовали стандарт ХГЧ, разведенный в ЗФРТ, контролем  служила моча здорового мужчины. Нижние контактные элементы хроматографических полосок опускали в подготовленные пробы, смешанные предварительно с  равным объемом конъюгата, на 5-7 секунд, после чего их переносили на то же время  в раствор ЗФРТ. Схема работы аналитической  системы представлена на рис. 7.

1

2

3

Рис.  7.  Схема иммунохроматографического  анализа

1 – контактный элемент 

2 – аналитическая зона

3 – впитывающий элемент

А-л – сорбированный  анти-лиганд (антитела к α-субъединице  ХГЧ)

К+ - внутренний положительный  контроль ( ХГЧ)

Стрелкой указано направление  движения фронта жидкости

А-л

К+

За  счет сил капиллярного всасывания раствор, содержащий гормон и детектирующий реагент, поднимался по полоскам со скоростью около 1,5 см/мин. Через 2-3 минуты результаты анализа определяли визуально по наличию (положительный результат) или отсутствию (отрицательный результат) связывания суспензоидного конъюгата в зоне иммобилизации первых антител (черные полосы на светло-сером фоне). Свидетельством корректно проведенного анализа являлась черная полоса в зоне иммобилизации внутреннего положительного контроля (рис. 8).

Приведенные результаты иммунохроматографического  определения ХГЧ демонстрируют  высокий уровень чувствительности за счет использования в качестве детектирующего реагента частиц коллоидного  углерода, конъюгированных с антителами к ХГЧ. Об этом свидетельствует окрашивание  в зоне иммобилизации первых антител  к ХГЧ при исследовании пробы, содержащей гормон в концентрации 10 МЕ/л. О высокой специфичности  анализа говорит отсутствие окрашивания  на поверхности иммуносорбента в  условиях отрицательного контроля. Полученные результаты были воспроизведены при  исследовании аналитических свойств  восьми синтезированных диагностикумов.

Рис. 8. Определение ХГЧ в варианте иммуно-хроматографического анализа 

1 - проба, не содержащая гормон; 2 - проба, содержащая ХГЧ в концентрации 10,0 МЕ/л; 3 - проба, содержащая ХГЧ  в концентрации 1000,0 МЕ/л; 4 - проба,  содержащая ХГЧ в концентрации 10000,0 МЕ/л

 

Сам по себе результат определения 10 МЕ/л говорит о привлекательных  аналитических характеристиках  разработанной системы диагностики. Ни одна из представленных на нашем  рынке систем определения ХГЧ, выполненных  в аранжировке иммунохроматографии, не обладает чувствительностью выше 20-25 МЕ/л. Более того, качество этих систем оставляет желать лучшего, о чем  свидетельствует рис. 9.

Рис. 9. Определение ХГЧ в реальных

условиях диагностики сертифициро-

ванными коммерческими тест-

системами

1,2 – моча здорового мужчины, 

3,4,6,7,8 – моча беременной  женщины

 в сроке 10-11 недель,

5 – дистиллированная  вода 

Автором не ставилась задача исследовать  аналитические параметры и оценить  достоинства или недостатки реализуемых  на отечественном рынке систем экспрессной  диагностики беременности. Выборка  из аптечной сети была случайной. Анализируя полученные результаты, корректной можно считать работу только трех из восьми проверенных диагностикумов.

Рис. 10. Приспособление (ячейка) для  иммунофильтрационного анализа

1 – ячейка в сборе, 2 – нижняя  часть корпуса, 3 – крупнопористый  впитывающий элемент, 4 – полипропиленовая  подложка, 5 – твердофазный иммуносорбент, 6 – крышка ячейки с отверстием  для внесения реагентов

Иммунофильтрационное определение  ХГЧ. Для осуществления иммунофильтрационного (называемого также проточно-адсорбционным) способа определения ХГЧ использовали те же иммунореагенты, что и в иммунохроматографии. Приспособлением для осуществления данного способа являлся пластиковый цилиндр с заглубленным отверстием в верхней части, заполненный крупнопористой хроматографической бумагой в качестве впитывающего элемента, с помещаемыми сверху опорным диском из крупнопористого полипропилена и иммуносорбентом (рис.10), который готовили, сорбируя на нитроцеллюлозном мембранном фильтре с диаметром пор 5 мкм связывающие моноклональные антитела к α-субъединице гормона в виде вертикальной линии из раствора с концентрацией 1,0 мг/мл ЗФР и сам гормон в качестве внутреннего положительного контроля в виде горизонтально пересекающей линии из раствора с концентрацией 50000 МЕ/л.

Высушенные  после нанесения анти-лигандов мембраны блокировали,  инкубируя в ЗФРТ-К 1 час при комнатной температуре, после чего отмывали ЗФРТ и вновь  высушивали таким же образом.

В ходе анализа  в отверстие крышки вносили 0,5 мл ЗФРТ для смачивания иммуносорбента. Затем - 0,5 мл предварительно подготовленной пробы, представляющей собой смесь  равных объемов исследуемого образца (моча беременных женщин или здоровых мужчин) и  конъюгата углеродных частиц с моноклональными антителами к  β-субъединице гормона в  двукратном от рабочего разведении. После  впитывания последней вносили 1 мл ЗФРТ для промывки поверхности мембраны. Время анализа 1,5 – 2 минуты. Результаты представлены на рис. 11.

Рис. 11. Иммунофильтрационное

определение ХГЧ 

«+» - положительная реакция,

«-» - отрицательная

Наличие «+» на поверхности мембраны свидетельствует  о присутствии в пробе ХГЧ, «-» - об отсутствии гормона и корректно  проведенном анализе.

Несомненным удобством аранжированного подобным образом анализа является его  простота и наглядность. По сути, в  наборе для реализации такого анализа  должны присутствовать только ячейки с подготовленным иммуносорбентом, флакон с конъюгатом и одноразовые  пластиковые пипетки, при помощи которых  последовательным набором  осуществляется смешивание исследуемого образца с конъюгатом и внесение готового раствора в ячейку. Для  промывки иммуносорбента используется капельница с ЗФРТ. Все восемь синтезированных  конъюгатов продемонстрировали корректный результат при исследовании 58-ми образцов мочи беременных женщин. В  ходе исследования 42 образцов мочи здоровых мужчин ложноположительных результатов  не наблюдали.

Дот-форматная аранжировка  аналитической процедуры полуколичественного  определения ХГЧ. Аранжирование определения ХГЧ в формате дот-иммуноанализа позволило разработать полуколичественный метод. Использовали уже описанное приспособление для нанесения проб на пористую мембрану «BIO-DOT Apparatus» (BIO-RAD, США). Условием проведения анализа являлась необходимость серийного разведения исследуемой пробы и сравнение последней визуализируемой точки со стандартом в известной концентрации. В качестве иммуносорбента использовали  нитроцеллюлозную мембрану с размерами пор 5,0 мкм с нанесенными анти-лигандами: моноклональными антителами к α-субъединице гормона, сам гормон из раствора с концентрацией 50000 МЕ/л в качестве внутреннего положительного контроля и ФСГ в качестве внутреннего отрицательного контроля. После полного высушивания нанесенных анти-лигандов мембрану блокировали, как описано выше, и вносили в лунки образцы референсных и исследуемых проб объемом по 100 мкл. В контрольные лунки вносили ЗФРТ. После полного прохождения образцов сквозь иммуносорбент осуществляли детекцию, инкубируя мембрану в растворе конъюгата моноклональных антител против β-субъединицы ХГЧ с углеродом в течение 15 Рис. 12. Дот-иммуноаналитическое

определение ХГЧ в варианте полу-

количественного анализа

Левый вертикальный ряд  точек – 

результаты определения  референсных образцов, правый –  исследуемых

минут. Результат оценивали после 3-х кратной промывки мембраны ЗФРТ (рис. 12).

Результаты  анализа, представленные на рис. 12, демонстрируют  чувствительность определения 5 МЕ/л. Визуализируемой  на  этом уровне точке референса  соответствует точка разведения исследуемого образца 1:10⁴, из чего следует, что исходное содержание гормона было равно 50000 МЕ/л. Аналогичные результаты были продемонстрированы всеми восемью синтезированными конъюгатами. Таким образом, разработанная схема дот-иммуноанализа, вполне пригодна для полуколичественного определения любых лигандов при условии наличия референсных образцов. Возможность количественной формализации результатов анализа в существенной степени приближает удобную в процедурном отношении, чувствительную и надежную в плане аналитических возможностей диагностическую сферу медико-биологических исследований к пользователям, удаленным от крупных центров, оснащенных современным оборудованием.

Описанные для определения ХГЧ форматные  аранжировки: иммунохроматография, иммунофильтрация и дот-иммуноанализ могут быть реализованы  в конструировании любых систем, имеющих такое же форматное оформление. Речь идет о подготовке твердофазного реагента (иммуносорбента) описанным способом, контакте его с исследуемым объектом (кровь, сыворотка, моча, экстракт, слюна, слеза и т.д.) и детекции соответствующим специфическим диагностикумом. Определяющими оценочными факторами с позиции целесообразности того или иного процедурного оформления являются порог диагностически значимого результата и индивидуальные свойства компонентов диагностической системы, способные или неспособные реализовывать требуемые аналитические характеристики,  в первую очередь, аффинность антител, структурная организация молекул, характер возможной контаминации. Что же касается самой углеродной метки, то и ее физико-химические параметры, и технология синтеза конъюгатов надежно гарантируют воспроизводимые качественные характеристики диагностикумов, обеспечивающие возможность их применения в любых процедурных аранжировках.

Прямое дот-иммуноаналитическое  определение стрептококка группы А. В качестве детектирующего реагента использовали конъюгат кроличьих антистрептококковых антител с частицами коллоидного углерода. Системой сравнения служила детекция ферментным конъюгатом кроличьих антител к стрептококку гр. А с пероксидазой хрена и проявлением результатов анализа с 4-хлор-1-нафтолом в стандартных условиях. На полоски нитроцеллюлозы с диаметром пор 0,45 мкм наносили АПСХ-БСА из серийных разведений в ЗФР дотами по 3 мкл и БСА в качестве отрицательного контроля. После высушивания нанесенных лигандов и блокирования поверхности полосок растворе ЗФРТ-К их обрабатывали Рис. 13. Сравнительное дот-иммуноаналитическое определение полисахарида стрептококка гр. А, сорбированного на НЦ мембране

А – детекция ферментным конъюгатом,

Б – детекция углеродным конъюгатом

сравниваемыми системами детекции (рис. 13).

Преимущество  неферментной детекции подтверждается, прежде всего, в два раза более  высокими показателями чувствительности. Отсутствие стадии субстратного проявления делает процедуру анализа более  оперативной, упрощает ее, исключает  вредность контакта с токсичным  субстратом ферментной реакции. Подобного рода система анализа, позволяющая в течение часа в кабинете врача или в условиях обычной клинической лаборатории определить наличие СГА в мазке больного с чувствительностью 40-80 нг/мл, могла бы стать действенным инструментом в первичной диагностике инфекции. Представленная модель аналитической системы демонстрирует преимущества и принципиальную возможность определения СГА углеродным конъюгатом, воспроизведенную в трех синтезах. В реальной аналитической практике возникает методическая проблема, связанная с подготовкой исследуемой пробы (лизис клеточной стенки бактерии), которая могла бы служить серьезным препятствием на пути внедрения описываемой диагностической системы в качестве оперативного инструмента. Существующее решение этой проблемы было апробировано в ходе разработки сэндвич-варианта дот-иммуноаналитической системы определения СГА.