Неинструментальные иммунодиагностические системы на основе углеродных наночастиц

 

Дот-иммуноаналитическое определение  стрептококка гр. А в варианте сэндвич-анализа. Сравниваемые системы детекции были те же, что и при прямом сравнении определения АПСХ. На нитроцеллюлозные полоски сорбировали антитела к стрептококку гр. А дотами по 3 мкл из раствора с концентрацией 1 мг/мл ЗФР и АПСХ-БСА в качестве внутреннего положительного контроля (К+) в той же концентрации. Полоски обрабатывали в блокирующем растворе по описанной выше схеме. Исследуемыми образцами служили клеточные лизаты с известным содержанием клеток в исходных пробах. Лизаты получали методом, разработанным в лаборатории стрептококковых инфекций ММА им. И.М. Сеченова [Шмакова и др., 1991]. Подготовленные иммуносорбенты инкубировали с анализируемыми образцами в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего отмытые в ЗФРТ полоски детектировали ферментным и углеродным конъюгатами. Результаты сравнительного анализа представлены на рис. 14.

Рис. 14. Сравнительное дот-иммуноаналитическое  определение стрептококка гр. А по анализу клеточных лизатов в  сэндвич-варианте

А – детекция ферментным конъюгатом,

Б – углеродным.

Доты в нижней зоне каждого  иммуносорбента – внутренний положительный  контроль

В представленном варианте анализа чувствительность неферментного определения стрептококка группы А составила 10⁴ клеток/мл, что существенно превышает чувствительность ферментного определения и соответствует рекомендациям ВОЗ, согласно которым данный показатель является необходимым порогом диагностически значимой чувствительности методов, особенно экспрессных,  и позволяет проводить идентификацию СГА непосредственно в мазке из зева.

Рис. 15. Полуколичественное определение  АФП в сыворотке беременной женщины  в аранжировке дот-иммуноанализа

Левый вертикальный ряд точек – результат  определения референсных образцов, правый – исследуемых

Дот-иммуноаналитическое определение  АФП и ТБГ в сыворотке крови  беременных женщин. Форматная аранжировка определения АФП и ТБГ фактически повторяет таковую, разработанную для полуколичественного определения ХГЧ, описанную выше. В процедуре подготовки твердофазного реагента, как и в ходе анализа, также использовали приспособление для нанесения проб на пористую мембрану. Анализировали образцы, полученные в результате серийного разведения исследуемой пробы (сыворотка крови беременной женщины в сроке 16 недель) в прямом сравнении с последней визуализируемой точкой раститрованного с шагом 2 референс-стандарта АФП. На нитроцеллюлозную мембрану с размерами пор 5,0 мкм наносили  аффинноочищенные козьи поликлональные антитела к АФП из раствора с концентрацией 0,1 мг/мл в ЗФР объемом 20 мкл, сам белок в качестве внутреннего положительного контроля (К+) и БСА в качестве отрицательного контроля (К-). После полного высушивания нанесенных анти-лигандов мембрану блокировали, и в лунки вносили образцы референсных и исследуемых проб объемом по 100 мкл. В контрольные лунки вносили ЗФРТ. После полного прохождения образцов сквозь твердофазный реагент осуществляли детекцию, инкубируя мембрану в растворе конъюгата поликлональных антител против АФП с углеродом в течение 15 минут. Результат оценивали после 3-х кратной промывки мембраны ЗФРТ (рис.15).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Чувствительность  определения АФП в представленном варианте анализа составила 10 нг/мл. Из этого следует, что концентрация АФП с учетом разведения в исследуемом  образце составляла около 40 нг/мл. Полученный результат согласуется с имеющимися данными, свидетельствующими о том, что медиана концентрации АФП  в материнской сыворотке при  сроке беременности 16 недель составляет  41 нг/мл (33 МЕ/мл) [Решетников, 2004, Tabor et al., 1987].

Для определения  ТБГ в сыворотке крови (беременность 16 недель) на мембрану наносили моноклональные антитела к ТБГ в той же концентрации и таким же образом, что и в  описанном определении АФП. В  качестве контролей использовали сам  белок – «К+» и АФП – «К-». В ходе анализа в лунки вносили  образцы референсного белка, раститрованного  с шагом 10 параллельно с исследуемыми образцами в аналогичном разведении. Детекцию осуществляли конъюгатом моноклональных антител к ТБГ с частицами  углерода (рис.16).

Рис. 16. Полуколичественное определение 

ТБГ в сыворотке беременной женщины 

в аранжировке дот-иммуноанализа

Левый вертикальный ряд точек – результат 

определения референсных  образцов, правый

– исследуемых

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Чувствительность  определения ТБГ в системе  дот-иммуноаналитического исследования составила  1,0 нг/мл. Следовательно, с учетом разведения концентрация определяемого  белка в исследуемой пробе  находилась в диапазоне от 10 до 100 мкг/мл. Согласно  литературным данным, среднее значение нормы ТБГ в  материнской сыворотке при сроке  беременности 16 недель составляет 48 мкг/мл [Богданович и др., 2004].

Безусловно, с позиций количественной формализации результатов, полученную точность определения  трудно назвать удовлетворительной, отсюда и квалификация разработанного метода как полуколичественного. Однако следует отметить, что для увеличения точности оценки результатов достаточно использовать более дробное разведение референсного и исследуемого материала.

Возможность количественной формализации получаемых результатов (даже с точки зрения оценки динамического «больше-меньше») может иметь особое значение при  анализе парных проб, когда исследования одного и того же параметра осуществляются через определенные временные промежутки (1-2 недели). Разработанная система  анализа может служить надежным инструментом, позволяющим динамически  следить за концентрацией ТБГ, отсутствие прироста которого при еженедельном определении позволяет диагностировать  наличие плацентарной недостаточности. 

Полуколичественная оценка процесса сероконверсии в ходе получения  специфических антител. Известна важность контроля за процессом выработки антител при иммунизации лабораторных животных. Наиболее широко используемым методом в современной лабораторной практике, является метод двойной радиальной иммунодиффузии в геле [Оухтерлони, 1949]. Метод достаточно демонстративный, но занимает слишком много времени, малочувствителен и страдает определенным субъективизмом в оценке результатов. Этих недостатков лишена дот-иммуноаналитическая система определения антител с использованием уже описанного углеродного конъюгата с G белком.

На нитроцеллюлозную мембрану с размерами пор 5,0 мкм  при помощи устройства «Био-Дот» наносили  АФП из раствора с концентрацией 0,1 мг/мл ЗФР объемом 20 мкл, в качестве внутреннего положительного контроля – IgG козы, в качестве внутреннего  отрицательного контроля - БСА. После  полного высушивания нанесенных анти-лигандов мембрану блокировали, как  описано выше, и вносили в лунки  образцы референсных и исследуемых  проб объемом по 100 мкл. Референсные  пробы – разведения козьих анти-АФП  антител с известной концентрацией  в ЗФР, исследуемые – разведения сыворотки крови иммунизированной козы. В контрольные лунки вносили  ЗФРТ. После полного прохождения  образцов сквозь иммуносорбент осуществляли детекцию, инкубируя мембрану в растворе конъюгата G белка с частицами углерода в течение 15 минут. Результат оценивали после 3-х кратной промывки мембраны ЗФРТ (рис.17).

Рис. 17. Полуколичественное определение  антител к АФП в сыворотке  иммунизированной козы

Левый вертикальный ряд  точек – результат определения  референсных образцов козьих антител  к АФП, правый - исследуемых образцов козьей сыворотки

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Время проведения анализа, если не считать время подготовки иммуносорбента, – 25 минут, чувствительность определения – 10 пг/мл. Анализируя полученные результаты, можно рассчитать примерную  концентрацию антител в исследуемой  сыворотке. Последняя визуализируемая  точка, равная 10 пг/мл, в ряду разведений сывороток соответствует разведению 1:10⁷.  Из этого следует, что концентрация антител в исследуемой сыворотке составляет 0,1 мг/мл.

 Описанную  систему анализа легко адаптировать  для определения практически  любых антител в любом биологическом  материале. Отсюда возможность  разработки систем простого и  надежного контроля за эффективностью  процессов вакцинации человека  и животных. Это могло бы найти  свое применение в ветеринарии,  особенно в условиях угрозы  эпидемического кризиса. 

Биотин-стрептавидиновые взаимодействия в иммунодиагностике.

Универсальность уже описанных систем детекции стереоспецифических  взаимодействий, основанных на использовании  в качестве аффинного соединения конъюгата G белка бесполезна, когда  единственным способом связывания определяемого  лиганда с твердой фазой является использование специфических антител. Решение проблемы в виде синтеза  конъюгата  с использованием вторых антител, конъюгированных с частицами  углерода  при этом не всегда возможно по ряду вполне определенных причин, чаще всего - экономических. На наш взгляд, уместно использование уникальных способностей биотина и стрептавидина. Стрептавидин - белок, вырабатываемый Streptomyces avidinii, обладающий очень высоким сродством к биотину, благодаря наличию в структуре его молекулы четырех центров связывания. Наиболее стандартное применения этого белка - выявление биотинилированной ДНК в методе нерадиоактивной гибридизации in situ, где обычно он используется в комплексе с флуоресцентной или ферментной меткой. Однако биотинилировать можно не только ДНК. Используя N-гидроксисукцинимидный эфир аминокапроидбиотина, можно легко биотинилировать практически любые белки, в том числе и антитела. Именно такие биотинилированные зонды мы использовали в системах диагностики, где в качестве универсального детектирующего реагента применяли уже упомянутый конъюгат стрептавидина с углеродными частицами, синтезированный по описанной для G белка одноэтапной схеме.

Определение столбнячного и ботулинического  анатоксинов на непористой твердой  фазе. В качестве основы твердофазного реагента использовали плоское дно лунок планшета, предназначенного для серийных разведений, изготовленного из белого полистирола фирмы Linbro (США). На дно лунок сорбировали антитела к столбнячному и ботулиническому анатоксинам дотами из капель по 5 мкл в концентрации 0,1 мг/мл в карбонатно-бикарбонатном буфере (КББ). После инкубации во влажной камере при температуре +37^оС капли удаляли, а поверхность иммуносорбента промывали ЗФРТ. В качестве внутреннего положительного контроля в каждой лунке сорбировали биотинилированный БСА, в качестве отрицательного – IgG человека. В лунки вносили исследуемые образцы соответствующих анатоксинов в ЗФРТ в разведении, кратном двум и после 30-ти минутной инкубации и двукратной промывки - соответствующие биотинилированные антитела: в одном случае - к столбнячному, в другом – к ботулиническому анатоксинам. Время инкубации составляло 30 минут, после чего лунки промывали ЗФРТ и осуществляли детекцию конъюгатом стрептавидина с углеродом в течение 15 минут (рис.18).  

Рис. 18. Определение столбнячного (А) и ботулинического (Б) анатоксинов  в системе биотин-стрептавидинового  взаимодействия

Левая точка в каждой лунке –  внутренний положительный контроль (К+), правая- исследуемый образец, внизу  – отрицательный контроль IgG (К-)

 

 

 

 

 

 

 

 

Чувствительность  анализируемой системы 10 и 100 нг/мл не может считаться достаточной  для целей реальной диагностики. Однако следует учитывать тот  факт, что емкость сорбции на непористой твердой фазе существенно ниже, чем  на пористых мембранах, что в конечном итоге и ограничивает диагностические  возможности систем анализа, сконструированных  на основе непористых материалов. В  то же время описываемый материал имеет несомненное достоинство  в том, что абсолютно не требует  процедуры блокирования своей поверхности  после комплексирования с анти-лигандами. Многочисленными экспериментами доказано отсутствие какого бы то ни было неспецифического взаимодействия углеродных конъюгатов с поверхностью полистирольного  планшета. Что касается исследования аналитических параметров определения, то они были воспроизведены в ходе тестирования 24-х стрептавидиновых конъюгатов. Демонстрируемая система тестирования при помощи стрептавидинового конъюгата позволяет прогнозировать реальную возможность конструирования такого же универсального инструмента, как и в случае с конъюгатом G белка с углеродными частицами. В системе аналитической процедуры достаточно сменить только твердофазный реагент и биотинилированные зонды, чтобы получить систему, способную определять практически любой лиганд, к которому возможно получение специфических антител. Что же касается возможностей повышения чувствительности определения, то можно выделить, как минимум, два направления. Первое предусматривает использование в качестве иммуносорбента пористых материалов с сорбированными на них анти-лигандами, второе - усиление результирующего сигнала, введением в систему детекции конъюгат биотина с углеродом.

В качестве примера универсальных возможностей разработанного метода можно представить  экспресс-применение биотин-стрептавидинового  конъюгата для дифференциальной детекции IgG.

А          Б

Рис. 19. Идентификация антител  в системе 

биотин-стрептавидиновой детекции

А - анти-кроличьи антитела,

Б - анти-козьи антитела

В ходе выделения и очистки одного из белков фетоплацентарного комплекса  человека с использованием двух аффинных сорбентов: козьи антитела против АФП  и кроличьи антитела против IgG человека, конъюгированных с сефарозой, в  получаемом препарате появилась  контаминация, верифицированная как IgG. Для идентификации видопринадлежности иммуноглобулинов использовали две  полоски нитроцеллюлозы с диаметром  пор 0,45 мкм, на которые сорбировали  контаминированные пробы и биотинилированный  БСА (Bi-БСА) в качестве положительного контроля. После блокирования в стандартных  для этой процедуры условиях, полоски инкубировали, в одном случае, с биотинилированными анти-кроличьими антителами, в другом – с биотинилированными анти-козьими антителами. После промывки иммуносорбентов осуществляли детекцию конъюгатом стрептавидин–углерод. Результаты анализа представлены на рис. 19.