Спид

 

Ген pol кодирует 3 фермента: протеазу (р22), обратную транскриптазу (р64/53) и  эндонуклеазу (р31). Эти белки образуются в результате протеолитического  расщепления предшественника с  молю массой 150кД. Несмотря на относительно небольшое количество этих белков в  вирионе (примерно 2 молекулы на вирион), антитела к ним выявляются в сыворотках больных СПИДом. Наиболее ярко выражена реакция с р31.

 

sor .Tретья открытая рамка  перекрывается с 3`-концом гена pol и кодирует белок с молю  массой 23 кД. Антитела к этому  белку удается выявить в сыворотках  больных СПИДом. По-видимому, белок  транслируется со сплайсированных  полиаденилированных РНК размером 5500 и 5000 нуклеотидов (см. Рисунок  2). Как показали опыты с использованием  инфекционной провирусной ДНК  ВИЧ, мутации в области гена  практически не влияли на способность  вируса реплицироваться и оказывать  цитопатогенное действие на CD4-клеточную  линию, если не считать небольшого  замедления этих процессов по  сравнению с исходным вирусом.  Тем не менее, высокая консервативность  нуклеотидной последовательности  гена sor указывает на наличие какой-то  функции продукта этого гена  в жизненном цикле вируса. Возможно, эта функция важна при репликации  в нелимфоидных клетках, например  в нервных и ретикулоэпителиальных.

 

env. иРНК, кодирующая белки  оболочки вириона, образуется  в результате сплайсинга, приводящего  к удалению из геномной РНК  большого интрона, содержащего  гены gag,  pol  и  sor  (см. Рисунок  2).  Образующаяся  иРНК   размером   4300  нуклеотида 

 

содержит открытую рамку  с типичным инициирующим AUG, которая  может направлять синтез белка, состоящего из 861 аминокислотного остатка с  мол. массой 97.5 кД. Этот белок предшественник в дальнейшем обильно гликозилируется, в результате чего его мол. масса  возрастает до 160 кД. Предшественник содержит 3 гидрофобные области, характерные  для оболочечных белков других ретровирусов. Первый гидрофобный участок (с 17-й  по 31-ю аминокислоты) соответствует  сигнальному пептиду, второй находится  в районе сайта протеолитического  расщепления белка-предшественника, третий является частью трансмембранного белка. В результате протеолитического  расщепления образуется 2 сильно гликозилированных  белка: наружный белок оболочки gp120 и трансмембранный белок gp41. Интересной особенностью трансмембранного белка  является наличие необычно длинной  последовательности (длиной в 150 аминокислотных остатков) гидрофильных аминокислот  вслед за гидрофобной частью трансмембранного белка. Эта последовательность, по-видимому, является внутриклеточным фрагментом gp41. Еще, как показали исследования, правильный процессинг gp160 происходит не во всех клеточных линиях. От чего это зависит, пока неизвестно.

 

3`-orf. Эта открытая рамка  расположена между 8347-м и 8992-м  нуклеотидами и простирается, таким  образом, в U3 область 3`-LTR. Кодируемый  этим геном белок имеет мол.  массу 27 кД и транслируется  со сплайсированной иРНК размером 1800 нуклеотидов (см. Рисунок 2).

 

Хотя антитела к этому  белку удается выявить в крови  больных СПИДом, он не является абсолютно  необходимым для репликации вируса. Продукт 3`-orf оказывает влияние на цитопатогенность вируса.

 

tat-3. Явление трансактивации  было впервые описано для ретровирусов  человека HTLV-1 и HTLV-2. Белок, осуществляющий  функцию трансактивации, кодируется  у этих вирусов небольшой открытой  рамкой, расположенной на 3`-конце  генома после гена env. Механизм  его действия заключается в  активации транскрипции структурных  генов вируса, вследствие чего  ген, кодирующий белок-трансактиватор, был назван tat (transactivator of transcription).

 

Феномен трансактивации выражен  у ВИЧ на несколько порядков сильнее, чем у HTLV-1 и HTLV-2. Как сейчас стало  ясно, за этот процесс у ВИЧ отвечают по крайней мере, 2 гена: tat-3 и art (trs). Первый из них кодируется иРНК размером около 2000 нуклеотидов, образующейся в результате сложного сплайсинга (см. Рисунок 2). Механизм действия белка tat-3 у ВИЧ значительно  сложнее, чем у аналогичных белков tat вирусов HTLV-1 и HTLV-2.

 

Продукт гена tat-3 - белок с  мол. массой 14 кД, выявляемый с помощью  сывороток больных СПИД. Мутации  в  5`-области первого кодирующего  экзона tat-3 нарушают способность вируса синтезировать структурные белки  и реплицироваться. Эти мутации  могут быть комплементированы в  клеточных линиях, постоянно экспрессирующих tat-3 белок. Сейчас получены линии как  В- так и Т-лимфоцитов, стабильно  трансформированных tat-3 геном и продуцирующих белок-трансактиватор. Другие клеточные линии, например HeLa, продуцирующие функциональный tat-3 белок, также могут поддерживать размножение мутантного по tat-3 ВИЧ. Использование подобных клеточных линий и клонированных провирусных ДНК, содержащих различного размера делеции в tat-3 гене, позволило изучить механизмы действия кодируемого этим геном белка.

 

art (trs). Другим белком, участвующим  в регуляции экспрессии структурных  генов ВИЧ является продукт  гена art (antirepression transactivator - антирепрессорный  трансактиватор). Транслируется он, по-видимому, с иРНК, принадлежащей  к тому же классу  молекул  размером 2000 нуклеотидов, что и  иРНКtat-3. Кодирующие экзоны гена art перекрываются экзонами tat-3 (см. Рисунок  2), а при сплайсинге используются  те же акцепторные и донорные  сайты. Однако при трансляции art функционирует инициаторный AUG с  координатой 5500, а не 5412, как для  гена tat-3. В результате, art читается  со сдвигом рамки отностительно  tat-3, что приводит к уменьшению  ее кодирующей рамки в первом  транслируемом экзоне с 214 до 76 нуклеотидов и к увеличению  во втором с 44 до 271 нуклеотида. Синтезируемый белок состоит  из 116 аминокислотных остатков, причем  основная доля приходится на  аминокислоты, проявляющие основные  свойства. Подобные белки обладают  сродством к нуклеиновым кислотам  и часто регулируют экспрессию  генов.

 

Действие продукта art осуществляется на посттранскрипционном уровне. По-видимому, он активирует трансляцию иРНК структурных  генов gag и env, снимая действие специфических  негативных регуляторов (см. ниже). Наряду с этим продукт art участвует и  в регуляции сплайсинга РНК, в  связи с чем для указанного гена было предложено другое название - trs (transregulator of splicing - трансрегулятор сплайсинга).

 

           РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ВИРУСНЫХ  ГЕНОВ.

 

Как было отмечено выше, геном  ВИЧ, помимо обычных ретровирусных  генов (gag, pol, env), содержит еще ряд  генов, функции которых заключаются  в регуляции экспрессии синтеза  структурных белков вириона. Если о  функции продуктов генов sor и 3`-orf мало что известно, кроме того, что  они не являются необходимыми для  репликации вируса, о действии продуктов  генов tat-3 и art имеется много данных, укладывающихся в определенную схему.

 

Первые опыты по изучению синтеза некоторых ферментов  в клетках, трансформированных рекомбинантными  ДНК, содержащими гены этих ферментов  под контролем LTR ВИЧ, показали, что  количество специфических иРНК резко  увеличивается (в 100-1000 раз) после введения в клетки  дополнительно активно  экспрессирующегося   tat-3 гена. Дальнейшие опыты показали, что продукт гена tat-3 увеличивает количество специфических  иРНК примерно в 10 раз, причем его действие опосредовано последовательностью, присутствующей в R-элементе LTR ВИЧ. Однако для максимального  эффекта tat-3-зависимой трансактивации необходимо присутствие последовательности U3 - элемента LTR. Таким образом, продукт гена tat-3 вызывает активацию транскрипции, и его активирующее действие осуществляется на этапе инициации транскрипции.

 

Важной частью tat-3-зависимой  трансактивации является активация  трансляции иРНК. Этот посттранскрипционный эффект tat-3-белка также опосредован  последовательностью R-элемента LTR ВИЧ. Эта последовательность была обозначена TAR (trains acting responsive) и локализована между  -17 и +80 нуклеотидами в LTR ВИЧ. Анализ первичной  нуклеотидной последовательности этого  участка показал наличие там 24-х  нуклеотидного обращенного повтора (между 1-м и 59-м нуклеотидами), который  может формировать петлю в  иРНК. Такая вторичная структура  иРНК может мешать 40S субъединице  рибосомы передвигаться вдоль иРНК при инициации трансляции и препятствовать, таким образом, синтезу продукта. Взаимодействие продукта гена tat-3 с  этим участком иРНК релаксирует структуру  и снимает, таким образом, препятствие  для трансляции. В эксперименте было выяснено, что делеции в TAR участке  снимали тормозящее действие R-элемента на трансляцию, однако полностью ликвидировали  эффект трансактивации. Таким образом,  tat-3 кодируемый белок или индуцированные им клеточные факторы узнают TAR последовательность как в ДНК (провирус), так и в  иРНК и активирует соответственно транскрипцию или трансляцию.

 

Действие другого гена-трансактиватора - art- осуществляется только на посттранскрипционном уровне. Продукт гена art(trs) участвует  в регуляции сплайсинга. Он снимает  репрессию специфических негативных регуляторов трансляции, расположенных  на иРНК, кодирующей белки gag и env. В отсутствие активного гена art(trs) нарушается синтез именно этих белков, в то время как  экспрессия других генов (например tat-3)  не нарушается.

 

Если суммировать приведенные  данные, то можно предложить такую  модель регуляции экспрессии генов  ВИЧ. Продукт гена tat-3, взаимодействуя с TAR последовательностью в LTR провируса, активирует транскрипцию провирусной  ДНК. Возможно, это происходит за счет уменьшения тормозящего действия на процесс транскрипции специфического негативного регуляторного элемента (NRE), расположенного между  -340-м и  -185-м нуклеотидами в U3 последовательности LTR ВИЧ.

 

Тот же tat-3 белок активирует и трансляцию иРНК, снимая ингибирующее действие на инициацию трансляции TAR-элемента. Для полноценного синтеза структурных  белков вириона необходимо действие еще одного белка - продукта гена art(trs). Этот белок появляется в результате описанных выше событий и переключает  сплайсинг  на производство иРНК структурных  генов. Этот же белок снимает действие негативных регуляторов трансляции, расположенных на иРНК, кодирующих структурные белки (gag и env). Предполагаемая цепь событий представлена на рисунке 3.

 

Конечно, предполагаемая схема  содержит много “белых пятен”. Так, пока не ясно, что является исходным толчком к активации провируса. Такая активация происходит при  антигенной стимуляции зараженного ВИЧ Т-лимфоцита, однако молекулярные механизмы этого явления не изучены. Важную роль в активации провируса может играть и взаимодействие вирусных генов с клеточными белками. Так, фактор транскрипции Sp1, присутствующий в клетках млекопитающих, связывается с промоторным участком в LTR промотора ВИЧ и активирует синтез РНК в 5-10 раз.

 

                       ТЕОРИИ ПРОИСХОЖДЕНИЯ ВИЧ.

 

Вопрос о происхождении  ВИЧ 1-го и 2-го типов является одним  из ключевых в современном понимании  проблемы СПИДа, поскольку его решение  в значительной мере определяет направления  диагностики, лечения и профилактики данной патологии.

 

Итак, известны следующие  возбудители СПИД:

 

n вирус иммунодефицита  человека(ВИЧ) - LAV/HTLV-3 (HIV, ВИЧ-1), распространенный  в основном в Америке, Европе, центральных, восточных и южных  районах Африки;

 

n родственные обезьяньим  вирусы подгруппы западно-африканских  Т-лимфотропных ретровирусов (LAV-2, HIV-2, ВИЧ-2), выделенные группой Л.Монтанье  в 1986 г. От больных СПИД африканцев  из Гвинеи.

 

n вирус HTLV-4, выделенный  американскими учеными от представителей  групп                    повышенного риска (Сенегал). Распространен  в основном в Африке.

 

Описаны случаи одновременного существования в организме человека ВИЧ-1,  ВИЧ-2 и HTLV-4 в различных сочетаниях.

 

По поводу происхождения  вирусов иммунодефицита человека в  литературе представлено много данных, порою противоречивых и не всегда полных. Споры продолжаются. По мере накопления материала возникли гипотезы происхождения ВИЧ, основные из которых  будут приведены ниже.

 

1.  Вирус создан искусственно  в конце 70-х годов текущего  столетия посредством методов  генной инженерии на основе  новых знаний о влиянии различного  рода излучений,  иммунодепрессантов  и мононуклеарных антител на  различные звенья иммунной системы.

 

2.   В естественных  условиях вирус иммунодефицита  человека может иметь антропогенное  происхождение, а именно:

 

·  ВИЧ - типичный экзогенный ретровирус, существовавший у людей  с древних времен и эволюционировавший вместе с человеком при его  расселении на Земле;

 

·   в глухих уголках   Центральной Африки ВИЧ циркулировал и вызывал эндемические заболевания  СПИД длительное время, затем через  о. Гаити попал в США и в  последующем довольно быстро распространялся  на все континенты;

 

·    ВИЧ - не  африканского происхождения, а возник и до нынешней пандемии, существовал в странах  умеренного климата (Северная Америка, Европа), в силу слабой патогенности вызывая отдельные заболевания, практически не диагностируемые  как СПИД

 

3. Зоонозное происхождение  вируса иммунодефицита человека, что могло быть реализовано  следующими путями:

 

·   в начале 50-х годов  нашего столетия конструирование ВИЧ  произошло при генетических рекомбинациях (видимо, случайных) вируса лейкоза  человека и животных (ретровируса  типа С) с вирусом опухоли молочной железы мышей (ретровирус типа В) или  с вирусом обезьяньего СПИД (ретровирус типа D);

 

·   в древние времена  мутанты вируса иммунодефицита зеленой  мартышки трансформировались и обрели нового хозяина - человека;

 

·   по структуре генома и биологическим свойствам ВИЧ  близок к лентивирусу висна и  вирусу инфекционной анемии лошадей, отмечается выраженная общность их внутренних (сердцевинных) белков.

 

Ряд авторов утверждают, что  пробел в структуре и свойствах  между вирусами иммунодефицита обезьян  и человека уже частично заполнен сходными вирусами HTLV-4, ВИЧ-2, а также  недавно открытым шведским ученым вирусом SBL, и процесс этот будет продолжаться.