Фотоэлектроколориметр

БХ 
Перечень практических навыков и умений: 
Уметь: 
1. Работать с ФЭКом, флуороскопом

Фотоэлектроколориметр

Для измерения оптической плотности  или светопропускания жидких растворов  по отношению к растворителю или  стандартному раствору предназначен фотоэлектрический  колориметр (ФЭК).

В основу работы этого прибора положен  принцип уравнения интенсивности  двух световых пучков, проходящих через  оптические среды, при помощи переменной щелевой диафрагмы.

Световые лучи от лампы, отразившись  от зеркал, проходят через светофильтры, кюветы и попадают на фотоэлементы, которые подключены к гальванометру. Так что при равенстве интенсивности  падающих на фотоэлементы световых пучков стрелка гальванометра стоит  на нуле.

При вращении барабана диафрагма, связанная  с ним, меняет свою ширину и тем  самым величину светового потока, падающего на фотоэлемент.

Фотометрически нейтральный клин служит для ослабления светового потока, падающего на фотоэлемент.

Способ измерения.

1.В пучок света помещают кюветы  с контрольным раствором.

2.Вращением ручки круговых фотометрических  клиньев устанавливают стрелку  гальванометра на нуль.

3.Затем в пучок света вводится  кювета с исследуемым раствором,  при этом стрелка гальванометра  отклоняется от нулевого положения.  Снимается показание.

4.Прибор  после окончания работы выключить.  Осторожно промыть кюветы. 
2. Пользоваться лабораторной центрифугой, термостатом, песчаной и водяной баней. Центрифу́га — устройство, (машина или прибор), служащее для разделения сыпучих тел или жидкостей различного удельного веса и отделения жидкостей от твёрдых тел путем использования центробежной силы. При вращении в центрифуге частицы с наибольшим удельным весом располагаются на периферии, а частицы с меньшим удельным весом — ближе к оси вращения.

Термоста́т — прибор для поддержания постоянной температуры. Поддержание температуры обеспечивается либо за счёт использования терморегуляторов, либо осуществлением фазового перехода (например, таяние льда)

Песчаные бани используют при необходимости в ещё более высоких температурных показателях. Они, по сути, являются  лотками с двумя термоэлектрическими нагревателями, куда засыпают кварцевый песок. Обрабатываемые образцы помещаются в рабочую зону, образуемую 10-15 мм равномерно прогретого верхнего слоя. Эксплуатационные преимущества таких приборов очевидны: экономичное энергопотребление, простота в обслуживании и высокая равномерность прогрева теплоносителя.

лабораторные водяные  бани обеспечивают более равномерное нагревание. Принцип их действия прост: сосуд с исследуемым материалом погружается в жидкость или, в случае с паровыми моделями, охватывается её парами. Поскольку в условиях нормального атмосферного давления температура кипения не превышает 100°C, её предельное значение устанавливается автоматически. Если силу нагрева требуется увеличить, они могут наполняться маслом или парафином (для t° до 250°С). 
3. Провести кислотный гидролиз белка.

Гидролиз казеина и  открытие в гидролизате фосфорной кислоты.

Ход работы. 100 мг порошка казеина растворяют в пробирке в 3 мл 10% раствора едкого натра или кали. Пробирку закрывают пробкой со стеклянной трубкой в качестве холодильника, закрепляют ее на асбестовой сетке металлической лапкой и нагревают. Через час после начала кипения жидкости гидролиз прекращают, жидкости дают остыть и нейтрализуют ее концентрированной азотной кислотой (12-15 капель) до слабокислой реакции на лакмус. При нейтрализации выпадает осадок высокомолекулярных продуктов неполного гидролиза белков (пептоны). После отстаивания жидкость фильтруют, с фильтром проделывают молибденовую пробу на фосфорную кислоту (к 20 каплям молибденового реактива добавляют 2-3 капли гидролизата и кипятят несколько минут на голом огне). Выпадает небольшой кристаллический осадок фосфорномолибденовокислого аммония (лимонно-желтого цвета).

12(NH₄)₂·Mo O₄ + H₃PO₄ + 21HNO₃ → (NH₄)₃PO₄·12Mo O₃ + 21 NH₄NO₃ + 12 H₂O

                                                   желтый кристаллический осадок

 
4. Провести очистку белка от  низкомолекулярных примесей методом  диализа и гельфильтрации на молселекте.

Очистка белков от низкомолекулярных  примесей методом диализа.

Принцип метода основан на неспособности молекул белка (коллоидных частиц) проникать через полупроницаемую мембрану (пергамент, целлофан, колодий и др.), в то время как низкомолекулярные примеси легко проходят через поры этих мембран. Метод диализа широко используется для разделения и очистки белков и других биополимеров от примесей солей и низкомолекулярных органических соединений. Основанный на этом же принципе метод гемодиализа (вивидиффузия), применяется для лечения больных с почечной недостаточностью (аппарат «искусственная почка»).

Ход работы. В подготовленный колодиевый или целлофановый мешочек поместить 1 мл сыворотки крови (раствора яичного белка) и 3-4 мл 6% раствора хлористого натрия, аккуратно поместить их в стакан с дистиллированной водой. Через 30-60 минут с небольшими порциями диализируемого раствора белка (содержимое мешочка) и диализата (наружная жидкость) провести пробы на хлориды и белок, чтоб удостовериться в том, что соль диффундировала, а белок остался в мешочке.

Для обнаружения белка провести биуретовую реакцию.

Принцип метода. Реакция основана на способности пептидной группы белков и полипептидов образовывать с ионами меди в щелочной среде комплексные соединения фиолетового цвета. Реакция позволяет обнаружить наличие пептидной связи в исследуемом веществе и, следовательно, является универсальной реакцией для обнаружения веществ белковой природы. Свое название реакция получила от производного мочевины биурета, который дает в данных условиях то же окрашивание, что и белок.

Техника проведения работы. В пробирку добавить 5 капель раствора белка, 10 капель раствора едкого натра и 1 каплю раствора сульфата меди. Отметить появление красно-фиолетового окрашивания.

Для обнаружения хлоридов к 0,5-1 мл раствора добавить 1-2 капли 1% раствора азотной кислоты и 1-2 капли 1% раствора азотнокислого серебра и отметить выпадение творожистого осадка.

 

Работа № 3. Очистка от низкомолекулярных примесей методом  гельфильтрации на сефадексе (молселекте).

Основным свойством декстранового геля, как хроматографического материала, является способность разделять вещества согласно размерам молекул. Крупные молекулы при хроматографии не проникают в частицы геля и элюируются в свободном объеме, т.е. в свободном пространстве между частицами геля. Применяя сефадексы (молселекты) разных типов с разными размерами частиц и изменяя условия хроматографии; гель-фильтрацию на сефадексах (молселектах) можно использовать для разделения смесей в зависимости от молекулярной массы, для определения чистоты веществ, а также в целях обессоливания и концентрирования растворов высокомолекулярных соединений и др.

Расчеты показывают, что на сефадексе Г-25 (молселекте Г-25) молекулы массой 5600 уже будут элюировать в свободном объеме, а соли и органические вещества с молекулярной массой в пределах 1000 проникают в частицы декстранового геля, обладая коэффициентом распределения 0,7-1,0. Это позволяет сравнительно легко отделить с помощью сефадекса Г-25 (молселекта Г-25) соли и низкомолекулярные органические примеси из растворов белков и других молекул.

Ход работы. Предварительно производят подготовку сефадекса (молселекта) и наполняют колонку. Для этого около 50 г сефадекса Г-25 (молселекта Г-25), достаточного для заполнения 7-8 колонок, необходимо суспендировать в стакане 0,1% растворе хлористого натрия (около 400 мл) и оставить для набухания на двое суток. Затем раствор соли из стакана слить, залить дистиллированной водой, суспензию сефадекса (молселекта) взболтать, дать осесть основной массе геля, а воду с неосевшими частицами слить. Отделение мелких частиц сефадекса повторить 4-5 раз.

Колонку размеров 2x10 см закрепить в штативе в строго вертикальном положении, на дно колонки поместить диск из плексигласа с отверстием и сверху на него опустить кружок фильтровальной бумаги. Колонку на 2/3 объема заполнить водой и в остальную часть постепенно вливать суспензию сефадекса высотой 2-3 см, начать медленно профильтровывать воду, продолжая добавление сефадекса. После образования слоя геля 5-6 см наполнение колонки прекратить, колонку закрыть и над слоем сефадекса поместить кружок фильтровальной бумаги. При наполнении колонки следить, чтобы в колонке не оставалось пузырьков воздуха, и над гелем был слой жидкости.

Для проведения работы открыть подготовленную колонку, дать профильтроваться воде над  слоем геля и наслоить пипеткой 1-1,5 мл 2% раствора гемоглобина или другого  окрашенного белка с равным объемом 3% раствора хлористого натрия. Как только раствор профильтруется (войдет в  гель), ополоснуть стенки колонки небольшим  количеством дистиллированной воды и начать элюирование дистиллированной водой со скоростью тока примерно 0,5 мл в минуту. Элюаты объемом 2,5-3 мл собирать в отдельные пробирки. Через 12-15 минут элюирование прекратить, в исходном растворе белка и в отдельных фракциях элюата проверить наличие белка по окраске содержимого пробирок и наличие хлоридов реакцией с азотнокислым серебром (см. выполнение предыдущей работы).

 
5. Определить концентрацию белка  сыворотки крови биуретовым методом.

Количественное определение  белка сыворотки крови биуретовым методом.

Клинико-диагностическое  значение. Сыворотка крови содержит смесь белков, различных по физиологическому значению, структуре и физико-химическому свойству. Нормальное содержание белка в сыворотке крови 65-80 г/л, у детей до 6 месяцев 48-56 г/л.

Изменение содержания белка  в сыворотке крови может свидетельствовать  о различных нарушениях. Снижение содержания белка (гипопротеинемия) может наблюдаться при потерях белка (кровотечения, болезни почек), при белковом голодании или при снижении процессов биосинтеза белка в результате различных заболеваний (интоксикации, злокачественных новообразований, хронических заболеваний). Повышенное содержание белка (гиперпротеинемия) бывает редко, это может быть при сгущении крови из-за значительной потери жидкости (длительная рвота, ожоговая болезнь, диарея), при наследственных заболеваниях - парапротеинемиях.

Одним из методов количественного  определения суммарного белка сыворотки  крови является биуретовый метод, который основан на способности белков, содержащих пептидные связи, образовывать с ионами меди в щелочной среде комплексные соединения фиолетового цвета. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию белка в растворе.

Техника выполнения работы. В пробирку налить 0,1 мл исследуемой сыворотки, в другую (контрольную)  – 0,1 мл 0,9% раствора хлорида натрия. В обе пробирки добавить по 5,0 мл биуретового реактива (ионы Сu⁺⁺ в щелочной среде). Содержимое обеих пробирок перемешать. Через 30 мин. измерить экстинкцию исследуемого раствора на ФЭКе в кювете толщиной 1 см при длине волны 540-560 нм (зеленый светофильтр) против контрольного раствора.

Содержание белка в  сыворотке крови (в г/л) найти по калибровочному графику, который построен с заранее известными концентрациями стандартного белка и выражает зависимость  между количеством белка в  крови и оптической плотностью (экстинкцией) окрашенного раствора.

Построение калибровочного графика.

Для этого применяют стандартный  белок – альбумин сыворотки крови. Из 10% стандартного раствора альбумина  в 4 пробирках готовят растворы белка  как показано в таблице.

№ пробирки	Стандартный 10% р-р альбумина, мл	0,9% раствор хлорида натрия, мл	Концентрация белка, г/л
1	0,4	0,6	40
2	0,6	0,4	60
3	0,8	0,2	80
4	1,0	–	100

 

Из каждой пробирки берут  по 0,1 мл раствора, добавляют к нему 5,0 мл биуретового реактива. Через 30 мин. измеряют экстинкцию на ФЭКе против контрольного раствора (0,1 мл 0,9% раствора хлорида натрия и 5 мл биуретового реактива).

Полученные значения откладывают  на оси ординат, а концентрацию белка (в г/л) на оси абсцисс.

 
6. Разделить белки сыворотки  крови мегодом высаливания.

Высаливание белков сыворотки крови сернокислым аммонием.

Реакция высаливания обусловлена дегидратацией макромолекул белка с одновременной нейтрализацией электрического заряда. Высаливание белков сернокислым аммонием может быть использовано для разделения белков друг от друга и получения их в кристаллическом виде. Например, глобулины сыворотки крови, имеющие большой молекулярный вес и меньший заряд легче высаливаются, чем альбумины. Глобулины осаждаются в полунасыщенном, а альбумины - в насыщенном растворе сернокислого аммония.

Высаливание белков – обратимый процесс. Осадок белка может вновь раствориться в воде после уменьшения концентрации солей. При этом белок не теряет своих естественных биологических свойств.