Фотоэлектроколориметр

Ход работы. В пробирку поместить 2 мл сыворотки крови и добавить равный объем насыщенного раствора сернокислого аммония, перемешать. Получается полунасыщенный раствор сернокислого аммония, в котором выпадает осадок глобулина.

Осадок отфильтровать через  бумажный фильтр в пробирку. К фильтрату  добавить сухой сернокислый аммоний  до полного насыщения раствора. Выпавший осадок альбумина отфильтровать  через бумажный фильтр. Проверить  фильтрат на отсутствие белка с помощью  биуретовой реакции.

Для доказательства обратимости высаливания, полученные осадки прямо на фильтрах смочить с 2-3 мл дистиллированной воды и отметить их растворение.

Сделать вывод.

 
7. Установить наличие белка ь  моче при протеинурии.

. Количественное определение  белка в моче по методу 

Брандберга-Робертса-Стольникова.

Клинико-диагностическое  значение. В норме моча не содержит белка в количестве, обнаруживаемом обычными химическими методами. Белок в моче появляется при заболеваниях почек, при нарушении белкового состава крови.

Принцип метода. В основе метода лежит проба Геллера – денатурация белка азотной кислотой. Экспериментально установлено, что при наслаивании на азотную кислоту, растворы, содержащие 0,0033% белка, дают белое колечко в промежутке между второй и третьей минутами после наслаивания. Если колечко появляется непосредственно после наслаивания раствора белка на азотную кислоту, то путем последовательного разведения исследуемого материала достигают такого максимального разведения, при котором появляется кольцо между второй и третьей минутами. Умножая разведение на 0,0033%, получается процентное содержание белка в моче.

Ход работы. Приготовить 2 ряда пробирок (по 8 в каждом). Во все пробирки первого ряда прилить по 1 мл концентрированной азотной кислоты.

В пробирках второго ряда развести исследуемую мочу методом кратных  разведений. Для этого в первую пробирку и вторую пробирки этого  ряда налить по 1 мл исследуемой мочи, во вторую и все последующие - по 1 мл дистиллированной воды.

После перемешивания из второй  пробирки перенести 1мл жидкости в третью, затем после перемешивания такой  же объем из третей пробирки перенести  в четвертую и т.д. до конца  ряда. Из последней пробирки 1мл жидкости вылить. Таким образом, получается следующий  ряд разведений исследуемой мочи: в первой пробирке моча исходной концентрации, во 2-ой – разведена в 2 раза, в 3-ей – в 4 раза, в 4-ой – в 8 раз, в 5-ой - в 16, в 6-ой - в 32, в 7-ой – в 64, в 8-ой –  в 128.

После разведения мочи произвести поочередное  наслаивание содержимого каждой пробирки на концентрированную азотную  кислоту. По секундомеру отметить, в  какой пробирке белое кольцо образовалось через 2-3 минуты после начала опыта.

Примерный расчет. Между 2-ой и 3-ей минутами белое кольцо образовалось в 5-ой пробирке, где разведение мочи 1:16.

Следовательно, концентрация белка  в исходной порции мочи равна:

                    0,0033% × 16 = 0,05%

 
8. Определить концентрацию белка  в моче по методу Робертса-Стольникова-Брандбсрга.

Количественное определение  белка в моче по методу

Брандберга-Робертса-Стольникова.

Клинико-диагностическое  значение. В норме моча не содержит белка в количестве, обнаруживаемом обычными химическими методами. Белок в моче появляется при заболеваниях почек, при нарушении белкового состава крови.

Принцип метода. В основе метода лежит проба Геллера – денатурация белка азотной кислотой. Экспериментально установлено, что при наслаивании на азотную кислоту, растворы, содержащие 0,0033% белка, дают белое колечко в промежутке между второй и третьей минутами после наслаивания. Если колечко появляется непосредственно после наслаивания раствора белка на азотную кислоту, то путем последовательного разведения исследуемого материала достигают такого максимального разведения, при котором появляется кольцо между второй и третьей минутами. Умножая разведение на 0,0033%, получается процентное содержание белка в моче.

Ход работы. Приготовить 2 ряда пробирок (по 8 в каждом). Во все пробирки первого ряда прилить по 1 мл концентрированной азотной кислоты.

В пробирках второго ряда развести исследуемую мочу методом кратных  разведений. Для этого в первую пробирку и вторую пробирки этого  ряда налить по 1 мл исследуемой мочи, во вторую и все последующие - по 1 мл дистиллированной воды.

После перемешивания из второй  пробирки перенести 1мл жидкости в третью, затем после перемешивания такой  же объем из третей пробирки перенести  в четвертую и т.д. до конца  ряда. Из последней пробирки 1мл жидкости вылить. Таким образом, получается следующий  ряд разведений исследуемой мочи: в первой пробирке моча исходной концентрации, во 2-ой – разведена в 2 раза, в 3-ей – в 4 раза, в 4-ой – в 8 раз, в 5-ой - в 16, в 6-ой - в 32, в 7-ой – в 64, в 8-ой –  в 128.

После разведения мочи произвести поочередное  наслаивание содержимого каждой пробирки на концентрированную азотную  кислоту. По секундомеру отметить, в  какой пробирке белое кольцо образовалось через 2-3 минуты после начала опыта.

Примерный расчет. Между 2-ой и 3-ей минутами белое кольцо образовалось в 5-ой пробирке, где разведение мочи 1:16.

Следовательно, концентрация белка  в исходной порции мочи равна:

                    0,0033% × 16 = 0,05%

 
9. Поставить  опыт с целью установить специфичность  и термолабильносгъ слюны, влияния активаторов и ингибиторов на активность амилазы слюны.

Специфичность ферментов.

Одно из более характерных свойств  ферментов -  их высокая специфичность. Ферменты специфичны как в отношении  типа катализируемых реакций, так и  в отношении субстратов, на которые  они воздействуют. Большинство ферментов  обладает абсолютной специфичностью, действуя только на   какой-либо один субстрат. Высокая специфичность  ферментов определяется соответствием  пространственной конфигурации активного  центра фермента и субстрата.

Амилаза слюны ускоряет гидролиз только полисахаридов (таких как крахмал, гликоген) до мальтозы, но не оказывает  действие на дисахариды.

Гидролиз крахмала под влиянием ферментов слюны идет согласно схеме:

 

Гидролиз крахмала под действием  амилазы проходит через стадию образования  декстринов. Крахмал дает с йодом  синее окрашивание, амилодекстрины («осколки», образующиеся после гидролиза  некоторых внутренних гликозидных связей)- фиолетовое, эритро- и ахродекстрины  (олигосахариды с меньшей молекулярной массой) – соответственно красно-бурое и желтое (цвет йода в воде). Конечные продукты гидролиза – мальтоза и глюкоза – имеют свободные альдегидные группы и дают реакцию Троммера, которая основана на способности углеводов при нагревании восстанавливать гидрат окиси меди (голубого цвета) в гидрат закиси (желтого цвета). При дальнейшем нагревании гидрата закиси переходит в красную закись меди.

О расщеплении крахмала можно судить на основании двух реакций:

1) реакции на крахмал с йодом  и 2) реакции Троммера.

Сахароза не имеет свободной €альдегидной или кетонной группы, поэтому не дает реакции Троммера. Реакция Троммера может быть положительной только в том случае, если сахароза расщепится на свои составные части – глюкозу и фруктозу.

Порядок выполнения работы

 Споласкивают рот, в чистую пробирку собирают 2-3 мл слюны, которую разводят в 5 раз.

В две пронумерованные пробирки приливают по 5 капель разведенной  слюны. В 1 пробирку добавляют 10 капель 1% раствора крахмала, во 2- 10 капель 1% раствора сахарозы. Обе пробирки помещают на 10 минут в термостат или водную баню при температуре 38^оС, после чего содержимое пробирок делят на 2 части, с одной проделывают реакцию на крахмал, с другой реакцию Троммера.

Качественная реакция  на крахмал

К исследуемой жидкости добавить 1-2 капли раствора Люголя. При наличии крахмала отметьте появление темно-синего окрашивания.

Реакция Троммера

К 5 каплям исследуемой жидкости прибавляют 5 капель 10% раствора NaOH и 5 капель раствора CuSO₄  и нагревают. В присутствии глюкозы и мальтозы выпадает желтый осадок гидрата закиси меди или красный осадок закиси меди. Полученный результат занести в таблицу.

№ п/п	Субстрат	Фермент	Температура	Реакция на крахмал с  йодом	Реакция Троммера	Выводы
1.
2.

 Сделайте вывод о субстратной  специфичности фермента.

 

Термолабильность ферментов.

Большинство ферментов термолабильны - при нагревании до 60-80^о утрачивают каталитическую активность. Степень инактивирования зависит от длительности теплового воздействия. При низких температурах ферменты хорошо сохраняются, но скорость ферментативного катализа снижается. В термолабильности ферментов можно убедиться на примере действия ферментов слюны: амилазы и мальтазы.

Порядок выполнения работы

В чистую пробирку отливают небольшое  количество разведенной слюны (2-3мл) и кипятят ее в течение 5-8 минут, после чего охлаждают В 3 пронумерованные  пробирки наливают по 10 капель 1% раствора крахмала. В 1 пробирку добавляют 10 капель слюны, разведенной в 5 раз, во 2-ю 10 капель прокипяченной слюны, в 3-ю 10 капель воды (качестве контроля). Все пробирки помещают в термостат или водяную  баню при температуре 38^она 10 минут. После этого проделывают качественные реакции на крахмал и реакцию Троммера на продукты расщепления.

Реакция на крахмал. К 5 каплям исследуемого раствора приливают 1 каплю раствора йода в йодистом калии. В присутствии крахмала появляется синее окрашивание. Полученный результат занести в таблицу.

№ п/п	Субстрат	Фермент	Температура	Реакция на крахмал с  йодом	Реакция Троммера	Выводы
1.
2.
3.

 

Влияние реакции среды (оптимум  рН) на действие ферментов слюны.

Для проявления максимальной каталитической активности ферментов требуются  определенные условия, в том числе  оптимальная концентрация водородных ионов. Каждый фермент наиболее активен  в пределах довольно узкой зоны рН, называемой оптимум рН. Активность ферментов уменьшается, если рН меняется в любую сторону от оптимального значения. Отклонение рН от оптимума влияет на степень ионизации фермента и  субстрата, может нарушить связь  между белковой частью фермента и  их простетическими группами, может влиять на связывание субстрата с ферментами.

Оптимальное значение рН для  некоторых ферментов

Фермент	рН
Пепсин	1,5-2,5
Трипсин	8,0-9,0
Сахараза  кишечная	6,2
Амилаза слюны	6,9-7,0
Липаза  желудочного сока	6,0
Липаза  панкреатическая	7,0-8,5
Каталаза	7,0

                                                                                                                                                                                                                                                                       

Порядок выполнения работ

В 7 предварительно пронумерованных  пробирок наливают 0,2 м раствор двузамещенного фосфорнокислого натрия и 0,1 м раствор лимонной кислоты в соотношениях, указанных в таблице. Получают буферные растворы с рН от 5,6 до 8,0. В каждую пробирку добавляют по 10 капель 1% раствора крахмала, по 10 капель слюны, разведенной в 100 раз. Перемешивают содержимое пробирок и помещают их в водяную баню или термостат при температуре 38^о на 5-10 минут (в зависимости от индивидуальных особенностей активности слюны).

Влияние рН среды на активность амилазы

№ п/п	Кол-во 0,2 м р-ра Na2HPO4, мл	Кол-во р-ра лимонной к-ты, мл	рН смеси	Кол-во 0,5% р-ра крахмала на 1% р-р NaCl	Кол-во разведенной слюны(1:100), мл	Окрашивание с йодом
1.	0,58	0,42	5,6	по 10 капель	по 10 капель
2.	0,63	0,37	6,0
3.	0,69	0,31	6,4
4.	0,77	0,23	6,8
5.	0,87	0,13	7,2
6.	0,94	0,06	7,6
7.	0,97	0,03	8,0