Фотоэлектроколориметр

8.0пределснис  активности аспартатаминогрансферазы. Колориметрический метод определения активности аспартат- и аланинаминотрансфераз в сыворотке крови.

Определение активности аминотрансфераз в сыворотке крови имеет важное значение для диагностики болезней печени. Для острого гепатита характерно раннее повышение активности аланинаминотрансферазы (АлАТ). При инфаркте миокарда в 95 % случаев в сыворотке крови повышается активность аспартатаминотрансферазы (АсАТ). В сыворотке крови здоровых людей активность АсАТ колеблется в пределах 0,028-0,139 мкмоль/л×сек, активность АлАТ – 0,028-0,196 мкмоль/л×сек.

Принцип метода. В результате переаминирования при участии АсАТ и АлАТ образуются, соответственно, щавелевоуксусная (ЩУК, оксалоацетат) и пировиноградная (ПВК) кислоты.

СООН              СООН                        СООН  СООН

|                         |     |  |

СН–NH₂     +      C=O                           C=O        + СН–NH₂    

|                         |                 ←→         |  |

CH₂                            (CH₂)₂ АсАТ      CH₂                        (CH₂)₂

|                         |                                   |                              |

COOH               COOH                       COOH                    COOH

аспартат       α-кетоглутарат           оксалоацетат          глутамат 

 

СООН              СООН                        СООН  СООН

|                         |     |  |

СН–NH₂     +      C=O                           C=O        + СН–NH₂    

|                         |                 ←→         |  |

CH₃                            (CH₂)₂ АлАТ      CH₃                        (CH₂)₂

                           |                                                                  |

                          COOH                                                       COOH

аланин         α-кетоглутарат            пируват                   глутамат 

Оксалоацетат при декарбоксилировании превращается в пируват. При добавлении кислого 2,4-динитрофенилгидразина ферментативный процесс останавливается и образуется гидразон пировиноградной кислоты. Последний в щелочной среде дает окрашивание, интенсивность которого пропорциональна количеству образовавшейся пировиноградной кислоты.

Техника выполнения работы.

Определение АсАТ.

Одновременно  готовят опытную и контрольную  пробы.

Опытная проба. В пробирку вносят 0,5 мл субстратного раствора, добавляют 0,1 мл сыворотки, помещают в термостат при температуре 37° С на 1 час. Затем добавляют 0,5 мл раствора динитрофенилгидразина и выдерживают при комнатной температуре 20 мин для развития реакции. Затем приливают 5 мл 0,4 н NaOH, тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 10 мин для развития окраски. Оптическую плотность измеряют на ФЭКе с зеленым светофильтром в кювете на 10 мм против контроля.

Контрольная проба. Содержит все ингредиенты опытной пробы за исключением сыворотки крови. Вместо нее берут 0,1 мл дистиллированной воды и инкубируют в тех же условиях, что и опытную.

Определение АлАТ.

Одновременно  готовят опытную и контрольную  пробы.

В опытную  пробирку вносят 0,5 мл субстратного раствора для определения АлАТ, затем добавляют 0,1 мл испытуемой сыворотки и помещают в термостат при температуре 37° С на 30 мин. Дальнейший ход анализа такой же, как при определении АсАТ.

В контрольную  пробирку вместо сыворотки крови  берут 0,1 мл дистиллированной воды.

Расчет активности ферментов производят по калибровочному графику, отражающему зависимость оптической плотности от содержания ПВК.

 
9. Количественное  определение остаточного азота  крови.

Принцип определения: в результате сжигания безбелкового фильтрата крови азот низкомолекулярных азотистых соединений переходит в состав иона NH4. Количество азота устанавливается по количеству кислоты, необходимой для связывания образовавшегося аммония.

В норме азот остаточный составляет 20— 40 мг%. Увеличение содержания азота  остаточного в крови наступает  при нарушении функции почек, печени, при усиленном распаде  тканей (гангрена, туберкулез, злокачественные опухоли). 
10. Количественное определение мочевины в сыворотке крови и моче. Количественное определение мочевины в моче по Рашковану.

Принцип метода. Основан на том, что мочевина с гипохлоритом натрия и фенолом образует продукт зеленого окрашивания.

Ход работы. В пробирку поместить 0,1 мл разведенной в 100 раз исследуемой мочи, добавить 7 мл этилового спирта и прилить 2 мл дистиллированной воды. К полученной смеси прибавить 1 мл 0,035 н раствора НСl, тщательно перемешать, добавить 1 мл 1,2 % NaOCl, вновь тщательно перемешать и сразу же добавить 1 мл 5 % раствора фенола. Содержимое пробирки хорошо перемешать и поместить на 25 мин в термостат при температуре 55-60° С.

Окрашенный  в зеленый цвет раствор охладить и колориметрировать на ФЭКе с красным светофильтром в кюветах толщиной 5 мм против воды.

Концентрацию  мочевины рассчитать с помощью калибровочного графика с учетом разведения мочи и суточного диуреза (1500-2000 мл).

Принцип в крови  
 
Мочевина под действием уреазы разлагается на углекислый газ и аммиак, который в щелочной среде с гипохлоритом натрия и фенолом образует индофенол синего цвета (метод Бертло). Светопоглощение образовавшегося продукта пропорционально содержанию мочевины в образце.

 
11. Количественное  определение креатинина в сыворотке крови и моче.

Количественное  определение креатинина в моче по Яффе.

Принцип метода. Метод основан на способности креатинина в щелочной среде взаимодействовать с пикриновой кислотой с образованием пикрата креатинина оранжево-красного цвета.

Ход работы. Приготовить опытную пробу: в цилиндр объемом 100 мл внести 0,5 мл мочи и 3 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты. Смесь тщательно встряхнуть и добавить 0,2 мл 10% раствора едкого натра, выдержать 10 мин при комнатной температуре и довести дистиллированной водой до 100 мл. Приготовить контрольную пробу: к 3 мл раствора пикриновой кислоты добавить 0,2 мл 10% раствора едкого натра и довести объем смеси дистиллированной водой до 100 мл. Приготовить стандартную пробу: к 0,5 мл стандартного раствора (содержит 8,8 ммоль/л, или 1 г/л креатинина) прилить 3 мл раствора пикриновой кислоты и 0,2 мл 10% раствора едкого натра, выдержать 10 мин при комнатной температуре и довести дистиллированной водой до 100 мл. Интенсивность окраски опытной и стандартной проб измерить на ФЭКе против контрольного раствора в кювете с толщиной слоя 10 мм при зеленом светофильтре.

Расчет: концентрация креатинина (моль/сут) = (Е_оп/Е_ст) × 8,8

Норма: 4,4 – 17,6 моль/сут, или 0,5 – 2 г/сут.

Клинико-диагностическое  значение. Содержание креатинина в моче зависит от характера питания, увеличиваясь при употреблении мясной пищи. Повышение его экскреции с мочой наблюдается при усиленной мышечной работе, лихорадочных состояниях, пневмонии авитаминозе Е, тиреотоксикозе и др.; понижение экскреции с мочой наблюдается при мышечной атрофии, лейкемии, амилоидозе почек, голодании.

Принцип определения креатинина методом Поппера

В щелочной среде пикриновая кислота  взаимодействует с креатинином с образованием оранжево-красной окраски (реакция Яффе — образование таутомера пикрата креатинина), которую измеряют фотометрически. Определение в сыворотке крови проводят после депротеинизирования, в моче — после разведения водой. Определение не совсем специфично, интерферируют вещества с активной метиленовой группой и некоторые восстанавливающие вещества, например глюкоза, ацетон, ацетоуксусная и пировиноградная кислоты.

 

 
12. Количественное  определение мочевой кислоты  в крови.

Количественное  определение мочевой кислоты  в сыворотке крови  по методу Мюллера-Зейферта.

Определение мочевой кислоты в сыворотке  крови производится с диагностической  целью. При подагре, пневмонии, анемии, почечной недостаточности, лечение  опухолей рентгенотерапией наблюдается  повышение содержания мочевой кислоты. Снижение уровня мочевой кислоты  возможно при акромегалии, применении дикумарола, кортизона, салицилатов и инъекций инсулина.

В норме содержание мочевой кислоты в сыворотке  крови взрослых составляет  у  мужчин - 0,24 – 0,50  млмоль/л (4,0-8,5мг/дл), у женщин – 0,16 – 0,40 млмоль/л (2,8-7,5 мг/дл).

Принцип метода. Мочевая кислота определяется в безбелковых фильтратах сыворотки крови по интенсивности синей окраски, развивающейся при  восстановлении фосфорновольфрамого реактива.

 

 

Техника выполнения работы.

В центрифужные пробирки вносят 1 мл сыворотки крови, добавляют 8 мл  дистиллированной воды, 0,5 мл  0,35М серной кислоты, перемешивают. Затем добавляют 0,5 мл 10% раствора вольфрамата натрия, опять переемешивают и через 10 мин.  Центрифугируют в течение 10 мин при 1500 об/мин. После осаждения белков сыворотки крови центрифугированием ставят опытную, стандартную и контрольную пробы.

Опытная проба: 3 мл надосадочной жидкости переносят в чистую прбирку.

Стандартная проба: 3 мл  0,03М стандартного раствора мочевой кислоты (1 мл  содержит 0,006 ммоль мочевой кислоты) налить в чистую пробирку.

Контрольная проба:  В чистую пробирку прилить 3 мл  дистиллированной воды.

Во все  три пробирки добавляют 1,5 мл  10,3%  раствора карбоната натрия, 1 мл  фосфорновольфрамового реактива, тщательно перемешивают и через 30 мин опытную и стандартную пробы фотометрируют при длине волны 590-700 нм (красный светофильтр) в кювете длиной оптического пути 1 см  против контрольной пробы.

Расчет: концентрацию мочевой кислоты рассчитывают по формуле:

                              С= Е_опыт./Е_станд.×Е_станд.×10, где

С – концентрация мочевой кислоты, ммоль/л;

Е_опыт. – экстинкция опытной пробы;

Е_станд.- экстинкция стандартной пробы;

С_станд. – концентрация стандартного раствора мочевой кислоты,

             0,03 ммоль/л;

10 – коэффициент пересчета на  объём сыворотки крови.

 
13. Общий анализ мочи: физико-химические  свойства, химический состав мочи, определение патологических компонентов  мочи.

Определение химических компонентов  нормальной мочи.

Качественное определение хлоридов

Налить в пробирку 1 мл мочи, добавить 2 - 3 капли 30% раствора азотной кислоты  и 3 - 4 капли 1% раствора азотнокислого серебра. Образуется творожистый осадок хлорида серебра. Написать реакцию.

Качественное обнаружение сульфатов

К 1 мл мочи добавить 2 - 3 капли 1% раствора уксусной кислоты и 2 - 3 мл раствора хлористого бария. Выпадает нерастворимый  осадок сульфата бария. Написать реакцию.

Обнаружение фосфатов

В пробирку налить 1 мл молибденового  реактива и нагреть его до кипения. После этого прибавить 5 - 6 капель мочи. Выпадает желтый кристаллический осадок фосфорно-молибденовокислого аммония, нерастворимый в азотной кислоте, но растворимый в аммиаке.

Обнаружение ионов кальция

К 1 мл мочи добавить 1 - 2 капли 3% раствора уксусной кислоты и 1 - 2 капли раствора щавелевокислого аммония. Выпадает осадок щавелевокислого кальция (кристаллы  под микроскопом имеют вид конвертиков). Написать реакцию.

Обнаружение аммиака

В пробирку налить 2 мл мочи, добавить равный объем раствора гидроксида кальция и над пробиркой держать смоченную водой красную лакмусовую бумажку. Через некоторое время бумажка синеет от выделяющегося аммиака.

Обнаружение креатинина (реакция Вейля)

К 1 мл мочи добавить 1 мл 10% раствора гидроксида натрия и 2 капли 10% раствора нитропруссида натрия, появляется красное окрашивание, которое впоследствии переходит в желтое.

Патологические  компоненты мочи.

1. Качественное определение белка.

Белок мочи состоит из сывороточного  альбумина и глобулинов. Кроме  того, на белок дает реакцию моча, содержащая кровь и гной. Белок  в моче обнаруживается с помощью реакций осаждения.

В нормальной моче содержится незначительное количество белка (0,05-0,15 г/сут), что не обнаруживается обычными качественными пробами. Белок в моче обнаруживается при нефрозе, нефрите, сердечной декомпенсации и при некоторых других патологиях. Пробы на белок мочи основаны на его денатурации различными агентами.

Проба кипячением

2 - 3 мл мочи (профильтрованной, если  она щелочная, то ее подкисляют уксусной кислотой до слабокислой реакции) довести до кипения и добавить 2 - 3 капли уксусной кислоты. Появление осадка, не растворяющегося при прибавлении кислоты, указывает на присутствие в исследуемой моче белка. Осадки фосфатов и карбонатов кальция и магния растворяются в более кислом растворе.