Метод Несслера

Цефалоспоринові антибіотики застосовуються в клінічній  практиці близько 40 років. За цей час  було синтезовано більше 50 сполук. Завдяки  високій ефективності і низькій токсичності, цефалоспоринові антибіотики посідають одне з перших місць по частоті клінічного використання серед всіх антибактеріальних засобів. В останні роки спостерігається тенденція до зниження ефективності цефалоспоринів у результаті значного поширення в медичних закладах госпітальних штамів мікроорганізмів зі зниженою чутливістю або стійких до цих антибіотиків [14].

Нераціональна антимікробна терапія спричиняє  підвищення частоти розвитку побічних реакцій, ріст бактеріальної резистентності, що є причиною подовження часу госпіталізації, а також обумовлює необхідність призначення інших лікарських засобів для лікування основного захворювання та усунення  наслідків неправильно обраного антибіотика. Все це збільшує вартість лікування, а якщо врахувати кількість таких хворих, то відповідно значно підвищує витрати держави на охорону здоров’я.

Поведений аналіз фармацевтичного ринку антибіотиків групи цефалоспоринів свідчить, що у світі є п’ять поколінь антибіотиків досліджуваної групи. На фармацевтичному ринку України представлені тільки чотири покоління цефалоспоринів [17].

На основі 13 субстанцій на фармацевтичному ринку  України у пропозиціях є 128 торгових найменувань лікарських препаратів. З них 44 вітчизняного і 84 імпортного виробництва.

Огляд фармацевтичного  ринку показав, що лікарські засоби групи цефалоспоринів представлені переважно імпортними препарами. Кількість пропозицій останніх на ринку перевищує пропозиції вітчизняних компаній-виробників у два рази. Найбільшу кількість пропозицій має лікарський препарат, що відноситься до третього покоління, цефотаксим – 25 пропозицій з них 18 імпортних і 7 вітчизняних фармацевтичних компаній. Найбільші обсяги споживання характерні для препаратів цефриаксон, цефазолін, цефотаксим, цефалексин. Таким чином, переважно препарати третього й першого покоління займають провідні позиції у використанні. Динаміка споживання препаратів: цефепім, цефотаксим, цефоперазон, цефтазидим, цефуроксим, цефпіром значно зростає [13].   

В останні  десятиліття в антимікробній  хіміотерапії чітко простежуються дві важливі тенденції. По-перше, істотно зростає резистентність грамнегативних мікроорганізмів до цефалоспоринів ІІІ покоління, головним чином, за рахунок продукції ними β-лактамаз різних типів і класів. Важливий механізм резистентності зумовлений гіперпродукцією хромосомних β-лактамаз за рахунок мутацій у регуляторних ділянках генома, що сприяють депресії синтезу ферменту. По-друге, сучасна тенденція пов’язана зі змінами спектра збудників госпітальних інфекцій, передусім у відділеннях інтенсивної терапії, реанімації, хірургічних стаціонарах за рахунок збільшення частоти

грампозитивних  мікроорганізмів і викликаних ними тяжких стаціонарних інфекцій – пневмоній, раневої інфекції, сепсису [12].

Препарати цефалоспоринового ряду на ринку  України представлені 39 фірмами  із 23 країн, включаючи Україну. Вітчизняною  промисловістю України освоєно шість препаратів цефалоспоринів (з урахуванням дозування) на трьох хіміко-фармацевтичних підприємствах: АТ "Київмедпрепарат", НВЦ "Борщагівський ХФЗ" і ВАТ "Фармак". Проте в даний час випуск здійснюється тільки на перших двох підприємствах. Це чотири найменування препаратів I та III поколінь: цефазоліну натрієва сіль пір. д / ін'єкцій по 1 г; цефалексин капсули 0,25 № 20; цефтриаксону натрієва сіль пір. д / ін'єкцій по 0,5 г; цефотаксиму натрієва сіль пір. д/ін'єкцій по 1 г [23].

 

 

 

 

 

 

ТЕХНОЛОГІЧНА  ЧАСТИНА РОБОТИ

РОЗДІЛ 3. Характеристика кінцевого  продукту − антибіотика цефотаксим

3.1. Характеристика цефотаксиму

Кінцевим  продуктом біосинтезу продуцента Acremonium chrysogenum, є антибіотик Цефотаксим.

Латинська назва – Cefatoxim.

Хімічна назва (IUPAC) – ([6R-[6альфа,7бета(Z)]]-3-[(Ацетилокси)мет-ил]-7-[[(2-аміно-4-тиазоліл(метоксииміно)ацетил]аміно]-8-оксо-5-тиа-1-азабицикло[4.2.0]окт-2-ен-2- карбоновая кислота (и у вигляді натрієвої солі)

Хімічна формула C₁₆H₁₇N₅O₇S₂ .

 

Рис.1.3. Цефотаксим (Cefotaximum)

Склад. Діюча  речовина: cefotaxime, 1 флакон міститьцефотаксиму натрієвої солі стерильної 100 % сухої у перерахунку на цефотаксим 0,5 г і 1 г.

Протипоказання:

 Підвищена  чутливість до бета-лактамних  антибіотиків. Неспецифічний виразковий  коліт, у тому числі й в  анамнезі. Тяжка хронічна ниркова  недостатність. Діти віком до 2,5 років (внутрішньом’язовий спосіб введення).

 

 

3.2. Фармакологія

Фармакодинаміка. Цефотаксим – цефалоспориновий антибіотик ІІІ покоління для парентерального введення. Діє бактерицидно, порушуючи синтез клітинної стінки мікроорганізмів. Має широкий спектр дії.

Активний  у відношенні грампозитивних та грамнегативних мікроорганізмів, стійких до інших антибіотиків: Staphylococcus spp., Staphylococcus epіdermіdіs, Streptococcus pneumonіae, Streptococcus pyogenes, Streptococcusagalactіae, Enterococcus spp., Enterobacter spp., Escherіchіa colі, Haemophіlusіnfluenzae, Haemophіlusparaіnfluenzae, Moraxella catarrhalіs, Klebsіella spp., Morganella morganіі,  Neіsserіa gonorrhoeae, Acіnetobacter spp., Corynebacterіum dіphtherіae, Erysіpelothrіx rhusіopathіae, Eubacter spp., Propіonіbacterіum spp., Clostrіdіum spp., Cіtrobacter spp., Proteus mіrabіlіs, Proteus vulgarіs, Provіdencіa spp., Serratіa spp., деяких штамів Pseudomonas aerugіnosa, Neіsserіamenіngіtіdіs, Neіsserіa gonorrhoeae, Bacteroіdes spp., Fusobacterіum spp., Peptococcus spp., Peptostreptococcus spp.

Стійкий до більшості бета-лактамаз грампозитивних та грамнегативних мікроорганізмів.

3.3. Застосування цефотаксиму

Бактеріальні  інфекції, спричинені чутливими доцефотаксиму  мікро організмами: бактеріальний менінгіт, інфекції ЛОР-органів, інфекції дихальних шляхів, інфекції сечовивідних шляхів, у тому числі гонорея, хламідіоз. Інфекції кісток, суглобів, шкіри та м’яких тканин. Інтраабдомінальній тазові икфекції. Інфіковані рани та опіки. Сепсис. Ендокардит. Хвороба Лайма (бореліоз). Сальмонельоз, шігельоз. Профілактика інфекцій після хірургічних операцій.

Цефотаксим  є препаратом вибора при “сліпому”  лікуванні інфекцій в період, коли ще не отримані результати бактеріологічного  аналіза, і може використовуватись замість відповідних комбінацій пеніцилінa з аміноглікозидами [11].

 

РОЗДІЛ 4. Обгрунтування вибору технологічної  схеми

4.1. Обгрунтування вибору біологічного  агента

Єдиним  продуцентом Цефотаксиму є Cephalosporium acremonium (Acremonium chrysogenum). Існує декілька штамів, які здатні синтезувати антибіотик, такі як Acremonium chrysogenum BKM F-4081D і Acremonium chrysogenum 12/9.

Acremonium chrysogenum BKM F-4081D  характеризується: на середовищі, яке містить бакто – пептон 10 г/л, мальтозу 40 г/л, мальт – екстракт сухий 20 г/л на 15 добу росту має діаметр колоній 0,7 мм. Оптимальна температура росту на агаровому середовищі – 24-28 ⁰С. Видимий ріст на 8 добу інкубації при 28 ⁰С. Якщо добавляти в це середовище 0,1% метіоніна, то на 15 добу росту діаметр колоній збільшиться до 0,9мм [21]. Але додавання метіоніна, є досить дороговартісним, тому не використовуємо в даній роботі.

Acremonium chrysogenum(Рис. 4.1.) є продуцентом антибіотику Цефотаксиму:

Рис.4.1. Acremonium chrysogenum

 Acremonium chrysogenum культивують на ферментаційному поживному середовищі, яке містить джерело вуглеводів – глюкозу, крохмал кукурудзи, джерело азоту – кукурудзяний екстракт, сульфат амонію, а  також неорганічні солі – фосфорнокислий калій, крейду,сіркокислий калій, сіркокислий марганець, сіркокислий цинк, сіркокислу мідь, сіркокисле залізо. Культивування гриба Acremonium chrysogenum здійснюють на поживному середовищі, яке містить джерела вуглеводів, азоту, неорганічних солей, амінокислот, жири в умовах інтенсивної аерації і перемішування [2].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4.2. Обгрунтвання вибору складу поживного середовища

Біосинтез Цефотаксиму здійснюються за умов культивування Acremonium chrysogenum в рідкому поживному середовищі, що містить джерела вуглецю, азоту та мінеральних солей. Acremonium chrysogenum культивують на ферментаційному поживному середовищі, джерелом вуглецю – глюкоза, крохмаль кукурудзи; джерело азоту – кукурудзяний екстракт, сульфат амонію. Містить неорганічні солі – фосфорнокислий калій, крейду. В якості рослинного жиру містить рослинну олію [15].

Відомі  способи біосинтезу Цефотаксиму, де в якості джерел вуглецю використовують переважно сахарозу [пат. США № 3926973, 1973 р., пат. США № 3826729, 1973 р., пат. США № 3816257, 1974 р., пат. Кореї № 9104371, 1991 р.]. Згідно з іншими даними [пат. Кореї № 9604037, 1993 р., пат. Німеччини № 4127648 С1, 1993 р.] як джерело вуглецю використовують переважно глюкозу або глюкозо - фруктозні суміш. За даними пат. США № 4533632, 1982 р., основним джерелом вуглецю є лактоза.

Недоліком перерахованих вище способів є використання в процесі біосинтезу досить дорогих видів джерел вуглецю, що отримуються в результаті переробки рослинної сировини.

Вирощують продуцент Цефотаксиму на данному  середовищі:

1 етап (одержання  ферментного гідролізату крохмалю).

У апарат для культивування культури Acremonium chrysogenum заливають половину від розрахункової кількості води, завантажують при перемішуванні кукурудзяний або картопляний крохмаль. Потім додають при перемішуванні хлорид кальцію, вносять комплексний ферментний препарат амілосубтилін Г3х. Температуру в апараті піднімають до (70 ± 5) ° С і витримують при цій температурі протягом 30 хв. Потім температуру швидко підвищують до 110 ° С і витримують протягом 3-5 хвилин для інактивації ферменту. Отримують ферментний гідролізат крохмалю, потім гідролізат використовують у приготуванні живильного середовища.

2 етап (приготування  поживного середовища і ведення процесу біосинтезу).

Отриманий на 1-му етапі гідролізат охолоджують  до 60 ° С, завантажують всі необхідні компоненти і доводять до об'єму водою.

Склад поживного  середовища (г/л):

Таблиця 4.2.1.

Компоненти поживного середовища	Вміст, г/л
Ферментний гідролізат кукурудзяного крохмалю	150
Кукурудзяний екстракт	120
Соєве борошно	1,275
Глюкоза	7,5
СаСО3	0,67
(NH4)2SO4	0,113
Олія рослинна	0,02
KH2PO4	0,047
Мікроелементи(сумарно)	0,048

 

Після стерилізації середовища в апарат з поживним середовищем передають вегетативний посівний матеріал культури Acremonium chrysogenum, що має величину водневого показника 7,2 рН. Кількість переданого посівного матеріалу становить 10% від обсягу поживного середовища. Процес культивування ведуть при наступних параметрах: температура (28±1) °С від 0 до 35 год, далі до кінця процесу (25±1) °С. Аерацію і перемішування здійснюють в режимі максимальної інтенсивності дихання, підтримуючи надлишковий тиск в апараті (0,06±0,01) МПа, а парціальний тиск розчиненого кисню не нижче 30% від насичення. Величину водневого показника підтримують на рівні (6,0±0,1) рН шляхом дозування аміачної води, розчину сульфату амонію і рослинної олії. Дозування розчину сульфату амонію здійснюють так, щоб масова частка амонійного азоту була в межах (0,05±0,1)%. Дозування рослинної олії здійснюють так, щоб парціальний тиск розчиненого кисню був не нижче 30% від насичення [18].

4.3. Обрахунок складу поживного  середовища

Скласти базове поживне середовище для вирощування  штаму Acremonium chrysogenum – продуцента цефотаксиму, якщо за 138 години культивування концентрація цефотаксиму в культуральній рідині становить 2,5 г/л, а концентрація біомаси 2 г/л.

Молекулярна маса цефотаксиму становить 455. У 455 г цефотаксиму міститься 192 г вуглецю, тоді у 2,5 г цефотаксиму вміст  вуглецю становить (2,5 × 192) / 455 = 1,05 г.

Далі  розрахуємо, в якій кількості глюкози  міститься ця кількість вуглецю. У 180 г глюкози міститься 72 г вуглецю, тоді 1,05 г вуглецю буде міститися в (180 × 1,05) / 72 = 2,6 г глюкози. Враховуючи, що при вирощуванні мікроорганізмів на глюкозі, близько 40 % субстрату окислюється до СО2 для одержання енергії, необхідної для конструктивного метаболізму, вміст глюкози в середовищі становитиме (2,6 × 0,4) + 2,6 = 3,6 г/л.

Потреби для синтезу біомаси. Припустимо, що у біомасі міститься     50 % вуглецю. Таким чином, у 2 г біомаси вміст вуглецю становить 1 г.

Розрахуємо  кількість глюкози, необхідного  для одержання 2 г/л біомаси. Молекулярна маса глюкози становить 180. Отже, у 180 г глюкози міститься 72 г вуглецю, тоді 1 г вуглецю буде міститися в (180 × 1) / 72 = 2,5 г глюкози. Враховуючи 40 % втрат субстрату на «холосте окиснення», для одержання 2 г/л біомаси, необхідно внести (2,5 × 0,4) + 2,5 = 3,5 г/л

Отже, загальний  вміст глюкози в середовищі, необхідний для синтезу біомаси (2 г/л) і цефотаксиму (2,5 г/л), становить 3,6 + 3,5 = 7,1 г/л.

Розрахунок вмісту в середовищі джерела азотного живлення

Потреби для синтезу біомаси. Припустимо, що в біомасі міститься     10 % азоту. Таким чином, у 2 г біомаси вміст азоту становить 0,2 г.

Для отримання  цефотаксиму в промислових умовах використовують середовище, яке містить  як джерело мінерального азоту сульфат  амонію (NH₄)2SO4.

Розрахуємо  кількість сульфату амонію, необхідного  для одержання      2 г/л  біомаси. Молекулярна маса (NH₄)2SO4 становить 132. Отже, у 132 г сульфату амонію міститься  28 г азоту, тоді 0,2 г азоту буде міститися у        (132 × 0,2) / 28 = 0,9 г солі.

Для одержання 2 г/л біомаси вміст (NH₄)2SO4 у середовищі культивування повинен становити 0,9 г/л.

Потреби для синтезу цефотаксиму. Азот входить до складу не тільки біомаси, але й цефотаксиму. Розрахуємо вміст (NH₄)2SO4 у середовищі, необхідний для одержання 2,5 г/л цефотаксиму.

Молекулярна маса цефотаксиму становить 455. У 455 г цефотаксиму міститься 70 г азоту, тоді у 2,5 г цефотаксиму вміст азоту становить            (2,5 × 70) / 455 = 0,38 г.

Далі  розрахуємо, в якій кількості сульфату амонію міститься ця кількість азоту. У 132 г сульфату амонію міститься 28 г, тоді 0,38 г азоту буде міститися в (132 × 0,38) / 28 = 1,8 г солі.