Метод Несслера

 

5.2. Морфолого-культуральні ознаки

Acremonium chrysogenum (цефалоспорій гострокінцевий) –  це недосконалий гриб.  Міцелій утворює щільні, шерстисті, спочатку білі потім рожеві колонії. Конідієносці являють собою бічні відгалуження гіф, прості. Конідії еліпсовидні або яйцевидні 3 – 4мкм, прямі, іноді зігнуті, зібрані у головки, до 16 мкм у діаметр [7].

      Рис.1.2. Зовнішній вигляд колоній Acremonium chrysogenum

     На агаризованих середовищах Acremonium chrysogenum утворює щільні, шершисті колонії. Колонії підведені, конусоподібні, нерегулярний складчасті, поверхня молодих колоній голкова, колір слонової кісті або рожеві, пігменту в середу не виділяють, повітряний міцелій дуже слабо виражений.

   Характер росту на поживних  середовищах. Поживне  середовище містить неорганічні солі, такі як гідрофосфат натрію, хлорид натрію, хлорид кальцію, сульфат кальцію, карбонат кальцію, сульфат магнію або гідро фосфат калію. Далі до живильного середовища можна також додавати жир, такий як складний метиловий ефір олеїновий кислоти або соєве масло. Поряд з цим також можна додавати мікроелементи, такі як солі заліза, марганцю, міді, цинку, кобальту або інших металів [16].

  Культивування Acremonium chrysogenum (Cephalosporium acremonium), здійснюють при 20-30, переважно при 25⁰С, і при значеннях ph=5-8, переважно при ph = 7. Культивування здійснюють спочатку аеробний в колбах для струшування, а потім у ферментері при перемішуванні і аерації за допомогою повітря або чистого кисню. Культивування мікроорганізмів у ферментерах здійснюють протягом 120 - 240, переважно 130 - 170 год [7].

5.3. Фізіолого-біохімічні ознаки біологічного агента   Acremonium chrysogenum - строгий аероб. Оптимальна температура росту на агаровому середовищі – 24-28 ⁰С, при значеннях ph=5-8, переважно при ph= 7.

Acremonium chrysogenum є хемоорганогетеророфом, тобто джерелом джерелом енергії у них є окисно – відновні реакції, донором електронів і джерелом вуглецю – органічна речовина.

Обраний біологічний агент не потребує факторів росту, проте на комплексних середовищах з природними субстратами, де зазвичай присутні ці речовини,  росте швидше і активніше.

Для даного мікроорганізму характерним є безстатеве розмноження конідіями (конідієспорами). Статевого процесу немає [19].

 

 

 

 

 

РОЗДІЛ 6. Опис технологічного процесу біосинтезу Цефотаксиму

6.1. Підрахунок кількості стадій підготовки посівного матеріалу

Загальний об’єм ферментера, в якому здійснюється культивування продуцента антибіотика  цефотаксиму– Acremonium chrysogenum, 3 м³. Коефіцієнт заповнення Кзап. = 0,6. Звідси слідує, що робочий об’єм ферментера:

Vроб. =   Vзаг. × Кзап  = 3 × 0,6 = 1,8м³ = 1800 л.

Визначаємо  кількість стадій підготовки посівного  матеріалу, для приготування 1800 л культуральної рідини. Кількість посівного матеріалу становить близько 10 % від загального об’єму поживного середовища.

  Для приготування 1800 л культуральної рідини, потрібно: 1800 × 0,1 = 180 л посівного. Таку кількість посівного можна приготувати у ферментері об’ємом 300 л.

Щоб приготувати 180 л культуральної рідини, потрібно мати: 180 × 0,1 = 18 л посівного матеріалу (приготування здійснюють у ферментері об’ємом 30 л).

Щоб приготувати 18 л культуральної рідини, потрібно мати: 18 × 0,1 = 1,8 л посівного матеріалу. Таку кількість посівного можна приготувати на качалочних колбах.

 Тобто,  процес підготування поживного середовища проходитиме в 3 етапи, 4-м етапом буде сам процес біосинтезу.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6.2. Опис технологічного процесу

ДР.1 Санітарна підготовка виробництва.

Для створення  оптимальних умов, які забезпечують випуск якісних ЛЗ, в останні роки були розроблені вимоги до виробництва  стерильної продукції. Щоб отримати лікарський препарат відповідної якості необхідно суворо дотримуватися поставлених вимог. Визнання на Україні міжнародних стандартів ISO, EN, правил  GMP, МВ 64У-1-97 “ Виробництво лікарських засобів ”,  які відповідають вимогам ЕS, дозволяє нашим виробникам перейти на більш високий рівень виробництва.

Для забезпечення всіх показників якості готової продукції, повинні створюватися спеціальні умови виконання стадій і операцій технологічного процесу; пред’являються особливі вимоги до  чистоти виробничих приміщень, роботи технологічного обладнання. Також певні вимоги до персоналу і виробничої санітарії.

Д.Р.1.1 Підготовка персоналу.

Виробництво лікарських засобів, ефективне його функціонування і забезпечення якості ліків залежать від відповідної підготовки персоналу. Міжнародні стандарти GМР, у розділі “Персонал”, висвітлюють основні вимоги щодо кваліфікації, підготовки та удосконалення кадрів, їх оптимального розміщення та використання таким чином, щоб забезпечити виконання завдань на сучасному рівні.

ДР.1.1.1 Навчання персоналу.

Навчання  персоналу повинно здійснюватися  відповідно до затверджених програм. 3 точки зору теорії і практики GМР, новопризначені працівники повинні пройти навчання у відповідності з їх посадовими обов'язками. Слід, відзначається у вимогах GМР ЄС, організувати безперервне навчання персоналу та контроль за якістю такого навчання. Персонал чи інші особи, які не пройшли відповідного навчання, не повинні допускатися до виробничих приміщень та лабораторій з контролю якості ліків. Однак у нашій державі до цього часу не існує системи післядипломного навчання для працюючих у сфері створення, виробництва та оптової реалізації ліків, що ускладнює процес входження фармацевтичної галузі до ЄС та виконання вимог GМР щодо персоналу.

Весь  персонал (включно задіяний прибиранням  та технічним обслуговуванням), працюючий  в чистих зонах, повинен проходити  систематичне навчання предметам, які  відносяться до правильного виробництва  стерильних продуктів, включаючи гігієну  та основи мікробіології .

ДР.1.1.2 Перевірка знань персоналу.

Перевірка знань  кадрової структури та методика визначення потреби у післядипломному навчанні фахівців промислової фармації надає можливість керівникам підприємств, удосконалення кадрів, з більшою чи меншою точністю, визначати розміри та обсяги післядипломного навчання, накреслювати основні напрямки подальшого розвитку і вдосконалення роботи з кадрами, їх навчання та перепідготовки, у відповідності з вимогами, нормами та стандартами GМР. Усе це сприяє підвищенню кваліфікації кадрів, активно впливає на якість лікарських засобів, підвищення продуктивності праці, а значить на покращення медикаментозного забезпечення населення України якісними, ефективними і недорогими ліками власного виробництва.

ДР.1.1.3 Санітарний контроль персоналу.

Найбільша кількість мікроорганізмів  виділяється з верхніх дихальних шляхів, волосся і шкірних покривів. Тому до персоналу виробничих приміщень пред'являються наступні вимоги:

- мити голову необхідно1-2рази на тиждень;

- рекомендується носити коротку стрижку;

- забороняється носити бороду;

- перед роботою 2 рази  на тиждень варто робити гігієнічний манікюр;

- забороняється використання косметики  під час роботи, покривати волосся і нігті лаком;

- забороняється носити ювелірні  вироби;

- забороняється вносити  у виробничі приміщення особисті  речі(документи, гроші, ключі, гребінці, носові хустки й ін.), а також зберігати їжу, приймати їжу, палити.

Не можна піднімати  і повторно користуватися предметами, що впали на підлогу під час роботи.

Про кожне захворювання (порізи, нариви, шкірні і простудні захворювання) необхідно доводити до відома майстра.

При надходженні на роботу персонал повинний пройти медичне обстеження.

Весь персонал, зайнятий безпосередньо  на виробництві, повинний проходити регулярні медичні огляди, а персонал, що здійснює візуальний контроль ін'єкційних препаратів, повинний проходити регулярні огляди лікарями-окулістами.

Антисептичні  засоби повинні забезпечувати знищення патогенних та сапрофітних мікроорганізмів  на шкірі рук персоналу. З цією метою використовують спирт етиловий 76 \%, 2,4 \%-й розчин рецептури С-4 (суміш розчинів перекису водню й мурав'їної кислоти), дегмін, 1 \%-й йодопірон 0,1 \%-й октенідерм, октенісепт й інші.

З метою запобігання  появи стійких варіантів мікробів та їх розповсюдження дезінфекційні  та антисептичні засоби слід чергувати  кожні 1—3 місяці.

ДР.1.2 Підготовка одягу. 

Технологічний одяг персоналу відповідає класу  чистоти тієї зони, в якій він  працює, і виконує своє основне  призначення — максимально захищає  продукт виробництва від часток, які виділяє людина.

Для класів А,В чистоти у відповідності  з GMP ми обираємо: комбінезон, бахіли, рукавички, маску, головний убір. Для С класу чистоти обираємо – косинку, брючний костюм, бахіли. Для D класу чистоти – халат або брючний костюм, технологічне взуття, косинку.

Підготовка цього одягу має ряд операцій:

Огляд технологічного одягу:

- прання  з вилученням механічних забруднень;

- ополіскування  і сушка, з метою забезпечення  асептики і стерильності;

- пакування  у стерильні пакети, для збільшення  терміну зберігання

Д.Р.1.2.1 Перегляд одягу.

Перед тим, як подати забруднений одяг на стадію прання, його переглядають. Технологічний одяг сортують відповідно за його призначенням та за ступенем зносу.

Д.Р.1.2.2 Прання одягу.

Прання  проводять протягом 45 хв із використанням мийного засобу "Лотос". Температура миючого розчину 30-40 ⁰C. Прання одягу здійснюють у пральній машині – автомат, де відбувається прання, ополіскування, віджим.

Д.Р.1.2.3 Сушіння одягу.

Випраний  одяг сушать стерильним повітрям при  температурі 80-90 ^оС протягом 45 хв в сушільній шафі.

Д.Р.1.2.4 Стерилізація одягу.

Стерилізація  може здійснюватись вологим або  сухим жаром, газоподібним стерилізуючим агентом, іонізуючим випрмінюванням.

Автоклавування. Стерилізація насиченим паром під тиском чи автоклавування – один із найбільш ефективних методів стерилізації, так як об’єкт, який стерилізується піддається одночасній дії як високої температури,

так і  підвищеному тиску пари. Гинуть як вегетативні клітини, так і спори  мікроорганізмів. Цей спосіб має  ряд переваг: можливість стерилізації одягу в упаковці, що виключає небезпеку  вторинної контамінації; найбільш економічний.

Тому  ми обираємо стерилізацію в автоклаві (А-4) при 119-121С, часом 45 хвилин, Р=0.9-0.11 МПа. В даних умовах гинуть не тільки вегетативні, але і спорові мікроорганізми.

Мікробіологічний  контроль технологічного одягу проводиться 2 рази в тиждень під час виробничого  процесу у кожному "чистому" приміщенні вибірково в декількох робітників й 1 раз в 2 тижні після стерильної обробки одягу. Відбір проб технологічного одягу проводять за допомогою змивів тампонами.

Д.Р.1.3 Підготовка дезінфікучих та миючих засобів.

Приготування  дезінфікуючих розчинів проводити  згідно ГенеральноїСОП 21-04-02 «Порядок приготування, зберігання та використання дезінфікуючих та антисептичних засобів». Начальник/мікробіолог цеху проводить моніторинг приготування та використання миючих, дезінфікуючих та миючо-дезинфікуючих розчинів.

Д.Р.1.3.1 Підготовка миючих засобів.

Серед миючих засобів на підприємстві використовують«Лотос»,  каустична сода.

Д.Р.1.3.1.1 Підготовка каустичної соди.

Каустична сода – це безбарвна, дуже гігроскопічна речовина, легко захоплює вологу повітря добре розчинна у воді. Розчини володіють високою миючою та бактерицидною дією.

Для миття  і дезінфекції використовують розчини каустичної соди 2 % - ної концентрації. Розчини готують дезустановках. Застосовуються переважно для механічного (циркуляційного) миття обладнання, виготовленого із нержавіючої сталі, в основному для теплообмінних препаратів.

Температура розчинів при обробці обладнання забезпечує повне очищення поверхні обладнання від залишків культуральної рідини, поживного середовища тощо.

Готується 2 % розчин каустичної соди, t = 26°С,  τ = 5 хв

Д.Р.1.3.2 Підготовка дезрозчину для приміщень.

Д.Р.1.3.2.1 Приготування розчину «Гембар».

Гембар (25 % концентрат, який розводять водою до потрібної  концентрації (0,1-0,5 %) закуповується  та зберігається на складі. Використовують для дезінфекції поверхонь, посуду, санітарно-технічного і медичного  обладнання.