Метод Несслера

Тому, для  одержання 2,5 г/л цефотаксиму вміст сульфату амонію в середовищі буде становити 1,8 г/л.

Отже, загальний  вміст сульфату амонію в середовищі, необхідний для синтезу біомаси (2 г/л) і цефотаксиму (2,5 г/л), становить 0,9 + 1,8 =  2,7 г/л.

Розрахунок вмісту джерела фосфору  в середовищі

У біомасі  міститься близько 3 % фосфору. Отже, для синтезу 2 г/л біомаси вміст фосфору у середовищі повинен становити 2 × 0,03 =  0,06 г/л. Джерелом фосфору у промисловому виробництві тобраміцину є дигідрофосфат калію КН₂РО₄.

Розрахуємо  кількість КН₂РО₄, необхідного для одержання 2 г/л біомаси. Молекулярна маса КН₂РО₄ становить 136. Отже, у 136 г дигідрофосфат калію міститься  31 г фосфору, тоді 0,06 г фосфору буде міститися у          (136 × 0,06) / 31 = 0,26 г солі.

Для одержання 2 г/л біомаси вміст КН₂РО₄ у середовищі культивування повинен становити 0,26 г/л.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4.4. Обгрунтування способу проведення  біосинтезу   Стадії біосинтезу (утворення) антибіотика. Це основна біологічна стадія складного процесу одержання антибіотичної речовини. Головне завдання на цій стадії - створення оптимальних умов для розвитку продуцента й максимально можливого біосинтезу антибіотика. Висока результативність стадії залежить від рівня біосинтетичної активності продуцента антибіотика, часу його максимального накопичення, складу поживних середовищ для культивування організму, у тому числі вмісту застосовуваних попередників, а також загальних енергетичних витрат на процеси, пов'язані з розвитком продуцента антибіотичної речовини.

До промислових  способів культивування мікроорганізмів  належать періодичне, поверхневе, безперервне культивування та культивування іммобілізованих клітин.

Найбільш  поширений спосіб періодичного культивування. При даному способі інокулят вносять  у поживне середовище, яке містить  задану кількість всіх необхідних поживних речовин. При цьому ні один з істотних компонентів поживного середовища не надходить у систему у процесі культивування, тобто це закрита система.

У безперервних процесах біооб'єкти постійно підтримуються  в експоненційній фазі росту. Забезпечується безперервний приплив свіжого поживного середовища в біореактор і відтік з нього культуральної рідини, що містить клітини та продукти їх життєдіяльності. Фундаментальним принципом безперервних процесів служить рівновага між приростом біомаси за рахунок поділу клітин і їх зменшенням у результаті розведення свіжим середовищем.

Поверхневе  культивування мікроорганізмів  застосовується як в лабораторних умовах, так і в промисловості. Недолік поверхневого способу – необхідність встановлення безлічі кювет, роботу з якими важко механізувати. 
Глибинне культивування мікроорганізмів має ряд очевидних переваг перед поверхневим, оскільки дозволяє значно скоротити виробничі площі, виключити важку непродуктивну ручну працю, покращити гігієну праці, спрощує механізацію та автоматизацію виробництва, робить можливим перехід на безперервний спосіб культивування. При глибинному способі культивування раціональніше використовуються поживні речовини середовищ, що дають можливість значно скоротити відходи виробництва у вигляді нерозчинних осадів твердого поживного середовища, отримувати препарати з меншим вмістом домішок і більшою питомою активністю. Глибинне культивування проводять у вертикальних герметичних ємностях різного розміру, що називаються ферментаторами [3].

Культивування A. chrysogenum проводимо глибинним періодичним методом. Тому, що цей мікрорганізм росте на рідкому поживному середовищі, потребує постійної аерації, частого технологічного контролю, також за глибинного методу культивування економляться виробничі площі.

4.4.1 Схема біотрансформації

В основу молекули Цефотаксиму входять L-цистеїн, D-валін і L-α-аміноадипінова кислота. Першим етапом біосинтеза є утворення трипептиду, який послідовно перетворюється на моноциклічний β-лактам.

Попередником L-цистеїну є 3-фосфогліцерат (проміжний  продукт обміну глюкози), D-валіну–піруват (продукт обміну вуглеводів), L-α-аміноадипінової кислоти – ацетил-КоА.

На рис. 4 наведена схема біотрансфомації антибіотика Цефатоксиму (див. додатоки 3, 5, 6, 7, 8) з глюкози у Acremonium chrysogenum [24].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4.5.Обгрунтування  вибору ферментаційного обладнання

Біореактори (ферментатори) складають  основу біотехнологічного виробництва. Маса апаратів, що використовуються, наприклад, в мікробній біотехнології, різна, і вимоги тут визначаються здебільшого економічними міркуваннями.  

Стосовно до ферментаторав розрізняють такі типи: лабораторні місткістю 0,5-100л, промислові ємністю 1-100 м³ і більше. При масштабуванні домагаються відповідності найважливіших характеристик процесу, а не збереження принципу конструкції. Застосована в біотехнології обладнання повинен вносити певну частку естетичності в інтер'єр цеху або відділення ( "пестити око"). У ході його експлуатації і поза її обладнання повинно бути легко доступним,містяться і що функціонує в певних рамках вимог гігієни і санітарії. У разі заміни будь-яких частин або деталей в апараті, чищення вузлів при поточному ремонті, і т. д., забруднення не повинні потрапляти всередину біореакторів, в матеріальні потокові комунікаційні лінії, в кінцеві продукти.   

Доцільно умовно обмежити апаратурним оформленням виробництв, що базуються на культивуванні: 1) бактерій і грибів, 2) клітин і тканин рослин, 3) клітин і тканин організмів тварин і людини. Такий підрозділ обумовлено тим, що бактерії і гриби в більшості своїй вирощують в однотипних біореакторах, що мають майже однотипну обв'язку, в яку входять: ферментатор, багатокорпусні вентиль стерильний (для подачі живильного середовища, посівного матеріалу, підживлення тощо), системирегулювання рН, подачі піногасника, система контролю витрат повітря, пробовідбірником, електродвигун.  К. Шюгерль в 1982 р. запропонував розділити біореактори на 3 основні групи відповідно до способу споживання енергії для перемішування і диспергирування г стерильного повітря (газу): - в біореакторах I типу енергія витрачається на механічний рух внутрішніх пристроїв; - в біореакторах II типу енергія витрачається на роботу зовнішнього насоса, що забезпечує рециркуляцію рідинита або газу; - в біореакторах III типу енергія витрачається на тиск і подачу газу в культуральну рідину.

Біореактори для аеробних процесів: з витратою енергії на механічний рух внутрішніх пристроїв а - 1, 2. 3; з витратою енергії на роботу насоса, що забезпечує рециркуляцію культуральної рідини б - 4; з витратою енергії на стиск і подачу газової фази в - 5 (г - газ. ж – рідка фаза, д - двигун).

Типи  ферментерів

1. Апарати, які мають дифузор з турбіною

Установки цієї групи мають в центрі концентрично розташований дифузор з відкритою  або закритою турбіною, що обертається. Вона може бути розміщена в різних місцях по висоті. Швейцарська фірма «Процес інженірінг» (фірма «Хемап») розробила універсальні мішалки з дифузорами [1].

        2. Самовсмоктувальні апарати з дифузором

Самовсмоктувальна турбіна створює розрідження  завдяки якому через полий  вал з верхньої частини апарату  та ззовні засмоктується повітря. Апарати  даної системи знаходять застосування в установках невеликої потужності [1].

3. Апарати з циркуляційним перемішуванням.

Ці апарати мають насоси та ежектори, які створюють направлений  тік рідини по замкнутому контуру. Ці ферментери часто оздоблюють «насадками», які забезпечують краще перемішування [5].       4. Ферментери з циркуляційною системою аерації

Застосування ежекторів  забезпечує розвинену поверхню фазового контакту повітря-рідина і тим самим  сприятливі умови для росту мікроорганізмів. Ефективні для середовищ, яким властива мала здатність до утворення піни. Апарат складається з ферментеру та циркуляційного контуру, в який включені насос і один чи кілька ежекторів. На кінці нагнітального трубопроводу встановлено сопло. Рідина циркулює за допомогою насоса [5].

5. Апарати з введенням енергії керуючим газом (барботажні апарати)

Розвинену поверхню газ-рідина забезпечують керамічні  аератори. Але в неї є головний недолік - дуже швидко забиваються пори. Розроблені апарати у вигляді резервуару з розташованими на його днищі повітророзподільними коробками прямокутного січення з перфорованими кришками та отворами 0,3 - 0,5 мм [5].

6. Апарати з дифузором (газліфтні)

Найбільш  широкого застосування набули апарати  системи Лефрасуа-Марійє, які мають  циліндричну форму з кільцевим  щілинним аератором. Прилад для циркуляції рідини представляє собою систему  труб, рівномірно розподілених по довжині  окружності ємності. Повітророзподілячі встановлені під кожною трубкою. Газліфтні апарати слугують для отримання білку [5].

7. Апарати з зовнішнім циркуляційним контуром

В цю групу  включені апарати з зовнішнім  циркуляційним контуром, окрім тих, в яких циркуляцію забезпечує насос. Їх можна розділити на дві груми:

- апарати  з циркуляцією, що забезпечується  піноутворюючими властивостями ферментаційного середовища за схемою рідина-піна-рідина;

- апарати  з виносним аераційним приладом.

Апарати ефективні  за умови досить високої циркуляції ферментаційної рідини [5].

8. Колонні ферментери

Застосовані в хімічній промисловості колонні  апарати застосовуються і в мікробіологічній промисловості. Це досить добрі масообмінні  апарати, однак мають дуже складну внутрішню конструкцію, а середовище та мікроорганізми здатні утворювати плівки, що важко змиваються. Існує два основних напрямки розробки та застосування колон в мікробіології:

1. організація  багатоступеневого процесу за  окремими тарілками;

2. використання  в якості апаратів повного  перемішування [5]. 

За способом перемішування біореактори бувають [5]:

1. Апарати з механічним перемішуванням
2. Апарати з циркуляційним перемішуванням
3. Апарати з пневматичним перемішуванням.

Отже, проаналізувавши  всі види ферментерів, для культивування Acremonium chrysogenum найефективнішим являється ферментер з механічним перемішуванням барботажного типу. Основною перевагою механічного перемішування є те, що можна легко змінювати технологічні умови та ефективно доставляти до зростаючих клітин повітря, що визначає характер розвитку мікроорганізмів і їх біосинтетичну активність. Для перемішування оберемо турбінну мішалку, оскільки турбінні мішалки забезпечують інтенсивне перемішування у всьому обсязі апарата. Потужність, споживана турбінними мішалками, що працюють в апаратах з відбивними перегородками, при турбулентному режимі перемішування практично не залежить від в'язкості середовища. Тому мішалки цього типу можуть застосовуватися для сумішей, в'язкість яких під час перемішування змінюється [5].

Проведення  культивування Acremonium chrysogenum передбачає забезпечення інтенсивного перемішування та аерації середовища. В обраному ферментері достатній рівень масообміну досягається встановленням відкритих та закритих турбінних мішалок та повітря, яке подається через барботер. Застосування відкритої турбінної мішалки розташованої над барботером також забезпечує високий рівень диспергування повітря, сприяючи збільшенню поверхні контакту фаз та коефіцієнту масопередачі.  Крім того, продуцент утворює міцелій, який досить важливим для біосинтезу антибіотика, використання турбінної мішалки дозволяє уникнути значного пошкодження міцелію.

Запропонований  апарат має високі масообмінні характеристики по кисню, в ньому легко можна  варіювати режими перемішування  та масообміну, забезпечується рівномірний розподіл мікроорганізмів та компонентів поживного середовища. Для забезпечення стерильності передбачено використання торцевих ущільнень валу перемішуючого пристрою з паровим захистом. Так вдається практично повністю запобігти потраплянню атмосферного повітря в апарат, що є дуже важливим для забезпечення асептичних умов культивування. Для створення в ферментері умов «повного відображення», для запобігання утворення обертального контура, котрий різко знижує інтенсивність перемішування, в апараті встановлюють перегородки (відбійники).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5. Характеристика біологічного агента

      5.1. Таксономічний  статус біологічного агента

Згідно  із систематикою грибів 70-80-х років  ХХ століття Cephalosporium acremonium відноситься до відділу справжніх грибів (Eumycota),  вегетативне тіло яких має вигляд переплетення гіфів, що утворюють міцелій, які поділяються на класи. Acremonium chrysogenum відноситься до класу дейтероміцетів (Deuteromycetes), у яких добре розвинутий міцелій, безстатеве розмноження конідіями.

Згідно  з систематикою Хоуксворта (1995 р.): Acremonium chrysogenum віднесений до царства Fungi, відділу “Mitotic fungi”, який не має самостійного таксономічного значення і найменування, тобто дейтероміцети.

Згідно  з систематикою Маргеліс – Шварц (1997 р.): Cephalosporium acremonium віднесено до царства Fungi, відділу Deuteromycota.

Згідно  систематики Кавалір – Сміта (1998 р.): недосконалий гриб Acremonium chrysogenum було віднесено до царства Fungi, підцарства Neomycota,  відділу Ascomycota, та класу Plectomycetes.

Згідно  філогенетичної класифікації грибів (2006 р.) Acremonium chrysogenum віднесено у підцарство Dikarya, яке об’єднує вищі гриби (аскоміцети і недосконалі гриби) [20].