Метод Несслера

На 100 мл поживного  середовища вноситься приблизно 1 мл мікроелементів. Тобто, на 1800 мл поживного  середовища потрібно внести близько 18 мл розчину 2. Для приготування потрібно:

ZnSO4 ×7H2O:       0,02 г – 1000 мл

                               х г – 1800 мл;              х = 0,036 г.

FeSO4×7H2O:       0,014 г – 1000 мл

                               х  г – 1800 мл;              х = 0,025г.

MnSO4×H2O:        0,01  г – 1000 мл

                               х  г – 1800 мл;              х = 0,018 г.

CuSO4×5H2O:        0,004 г – 1000 мл

                               х  г – 1800 мл;              х = 0,0072 г.

Розчин  готуємо у 20 мл дистильваної води.

 Стерилізацію проводимо при температурі 131 °С, р = 1,5 атм, протягом 40 хв.  

ДР-4.2. Приготування компонентів поживного  середовища для ферментера об’ємом 30 л (ІІ генерації).

Наступним етапом є приготування 18 л посівного  матеріалу, для цього необхідно  приготувати поживного середовища:

18 л –  1,8 л = 16,2 л,  де 1,8 л – кількість  посівного матеріалу із попереднього етапу.

Для приготування такої кількості поживного середовища потрібно:

Розчин 1:       1,8 л – 30 мл

                       16,2 л – х;                  х = 270 мл;

                       1,8 л – 600 мл

                         16,2 л – х ;                х = 5400 мл = 5,4 л;

 

Розчин 2:         1,8 л – 450 мл

                         16,2 л – х ;                х = 4050мл = 4,05 л;

                         1,8 л – 20 мл

                         16,2 л – х;                  х = 180 мл;

Всього готуємо 270 мл + 5400 мл + 4050 мл +180 мл = 9900 мл = 9,9 л

Враховуючи, що 10 % вологи додається за рахунок  утворення конденсату: 9900 мл – 990 мл = 8910 мл = 8, 91 л

ДР-4.2.1. Приготування і стерилізація розчину 1

Для приготування розчину 1 потрібна така кількість глюкози, аби отримати 40 % розчин: 30 мл – 12,8 г

                                       270 мл – х;       х = 115,2 г;

Тому, 115,2 г глюкози розчиняємо у 270 мл дистильованої води.

Ферментний  гідролізат

кукурудзяного крохмалю:      1 л  –  270 г

                                  16,2 л –   х г                   х = 4374 г = 4,4 кг

кукурудзяний  екстракт:                   1 л – 216 г

                                              16,2 л – х г              х = 3500 г = 3,5 кг

Розчин стерилізуємо при t = 112 °С, р = 0,5 атм,  τ = 30 хв.

ДР-4.2.2. Приготування і стерилізація розчину 2

  Для приготування розчину 2, потрібно:

(NH₄)2SO4:  х = 16,2 • 4,9 = 79,4 г

КН2РО4:     х = 16,2 • 0,47 = 7,6 г

соєве борошно:  х = 16,2 • 2,3 = 37,3 г

СаСО₃:                х = 16,2 • 1,21 = 19,6 г

Розчин 2 готуємо в 600 мл дистильованої води. Спочатку знижуємо рН до 4,5, охолоджуємо, і доводимо рН до 6.

ZnSO4 ×7H2O:     х = 16,2 • 0,036 = 0,6 г

FeSO4×7H2O:      х = 16,2 • 0,025 = 0,405 г 

MnSO4×H2O:       х = 16,2 • 0,018 = 0,3 г 

CuSO4×5H2O:      х = 16,2 • 0,0072 = 0,12 г

Стерилізацію  розчину 2 проводимо в автоклаві при таких параметрах: 

  t = 131 °С, р = 1,5 атм,  τ = 40 хв.

ДР-4.3. Приготування компонентів поживного  середовища для ферментера об’ємом 300 л (ІІІ генерації)

Далі  потрібно приготувати 180 л посівного  матеріалу, для цього потрібно поживного середовища: 180 л – 18 л = 162 л, де 18 л – кількість посівного матеріалу із попереднього етапу.

ДР-4.3.1. Приготування і стерилізація розчину 1

Розчин глюкози:       16,2 л – 270 мл

                                   162 л – х;                  х = 2,7 л ≈ 3 л;

115 г глюкози  розчиняємо у 3 л дистильованої води.

Ферментний  гідролізат

кукурудзяного крохмалю:      1 л  –  270 г

                                             16,2 л –   х г                   х = 4374 г = 4,4 кг

кукурудзяний  екстракт:                   1 л – 216 г

                                                          16,2 л – х г              х = 3500 г = 3,5 кг

 Стерилізацію  проводимо у автоклаві при t = 112 °С, р = 0,5 атм,  τ = 30 хв.

ДР-4.3.2. Приготування і стерилізація розчину 2

  Для приготування розчину 2, потрібно:

(NH₄)2SO4:  х = 16,2 • 4,9 = 79,4 г

КН2РО4:     х = 16,2 • 0,47 = 7,6 г

соєве борошно:  х = 16,2 • 2,3 = 37,3 г

СаСО₃:                х = 16,2 • 1,21 = 19,6 г

Розчин  2 готуємо в 600 мл дистильованої води. Спочатку знижуємо рН до 4,5, охолоджуємо, і доводимо рН до 6.

Для приготування 162 л поживного середовища, потрібна така кількість солей та борошна:

(NH₄)2SO4 – 10 кг;

КН2РО4 – 0,96 кг;

CaCО3 − 2,5 кг;

ZnSO4 ×7H2O – 4,5 г;

FeSO4×7H2O – 3,2 г;

MnSO4×H2O – 2,3 г;

CuSO4×5H2O – 0,9 г;

Соєве борошно  – 4,7 кг

Наважки солей завантажуються у ферментер місткістю 300л і заливаються 123 л водопровідної води. Для запобігання випадання фосфорних солей в осад, рН середовища доводиться до значення 4,5 - 5 за допомогою 6 % HCl. Параметри стерилізації такі: t = 131 °С, р = 1,5 атм,  τ = 40 хв . Після стерилізації розчин охолоджується і його рН доводиться до значення 7,0 за допомогою стерильного 10 % розчину NaOH.

ДР-5. Підготовка і стерилізація піногасника

ДР-5.1. Приготування піногасника

В якості піногасника використовується олія рослинна. Завантажується необхідна  кількість для стерилізації.

ДР-5.2. Стерилізація піногасника

Стерилізацію  проводять при 120 ºС протягом 30 хвилин, Р = 0,075 МПа.

   ТП-6. Підготовка посівного  матеріалу 

Для засівання  готують посівний матеріал глибинним періодичним способом.

ТП-6.1. Приготування інокуляту І генерації Acremonium chrysogenum (чашки Петрі) приготування 1,8 л інокуляту:

В колбу  місткістю 2 л зливаємо стерильні розчини 1, 2 від ДР-4.1.1., ДР-4.1.2. Розливаємо дане поживне середовище по 100 мл в попередньо простерилізовані качалочні колби місткістю 750 мл. В стерильних умовах в кожну качалочку колбу вносимо посівну культуру зі скошеного агаризованого середовища в пробірках (8 пробірок з культурою). Колби ставимо на качалки з частотою обертання 120 об/хв. При температурі 37 °С протягом 2 діб. Значення рН = 6.

ТП-6.2. Приготування інокуляту ІІ генерації

Приготування 18 л інокуляту:

Стерильні розчини 1, 2 від ДР-4.2.1., ДР-4.2.2. Зливаємо у попередньо простерилізований ферментер місткістю 30 л в стерильних умовах (зливаємо у зливний бачок при палаючому факелі). Потім вносимо 1,8 л посівного матеріалу, приготовленого на попередньому етапі. Культивування проводиться протягом 2 діб при Т = 37 °С, рН = 6 при постійному перемішуванні і аерація.

ТП-6.3. Приготування інокуляту ІІІ генерації

Приготування 180 л інокуляту:

Даний етап проводять у ферментері об’ємом 300 л. Після змішування всіх компонентів середовища, додається посівний матеріал зі стадії ТП 6.3. Приготування посівного проводиться при Т = 37 ºС, t = 48 год, рН = 6.

ТП-7. Виробниче культивування

ТП-7.1. Виробниче культивування

До загального об’єму стерильного розчину солей подаємо розчин глюкози і засіваємо середовище приготовленим на попередньому етапі інокулятом (180 л).

Культивування проводиться протягом 5 діб при  Т = 37 °С, рН = 6 при постійному перемішуванні і подачі очищеного повітря.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6.3. Контроль виробництва

Згідно  науково-технічної документації на підприємстві забезпечується контроль процесу виробництва антибіотика  та контроль готової продукції. Це здійснюється для забезпечення відповідності  готової продукції вимогам.

Упродовж  всього процесу виробництва продукту, неюхідно проводити контроль санітарного стану цехів та робочих місць, відповідність сировини, допоміжних матеріалів, та ін.

Таблиця 6.3.1.

Карта постадійного контролю

Номер контрольної точки та назва  стадії	Об’єкт контролю і показник, що визначається	Методи контролю	Періодичність перевірки та порядок відбору проб	Нормативна характеристика показника, щовизначається
1	2	3	4	5
К 1.3.1.1.      Технологічний контроль приготування розчину каустичної соди	Концентрація розчину	Фізичні методи визначення концентрації.	Після приготування розчинів.	С = 2 %
К 1.4.1., К 1.4.2. Мікробіологічний контроль  виробничих приміщень	Мікробіологічна чистота поверхонь виробничихприміщень (стіни, підлога, двері),	Змиви тампонами або метод відбитків	Щоденне прибирання. 1 раз на тиждень.	В змивах з площею 10х 10 см допускається ріст не більше 50 мікроорганізмів (бактерій і грибів сумарно);
К1.5. Технологічний контроль миття обладнань та комунікацій	Температура та час	Термометр технічний, годинник	Під час проведення миття	t= 70 oC τ = 15 хв
К1.5.1.2  Технологічний контроль герметичності обладнання	Тиск	датчик	Після миття та ополіскування обладнання	Р=0,5–0,6 МПа, τ = 30 хв
К1.5.1.3 Мікробіологічний та технологічний  контроль стерилізації обладнання та комунікацій	Режим стерилізації вузлів обладнання. Тиск. Температура. Мікробна контамінація.	Манометр технічний Термометр Мікробіологічний метод, висіви на чашки Петрі	Температура та тиск визначаються безперервно під час виробничого процесу.	p = 0,3 МПа t = 140oC τ = 20 хв КУО < 1
К2.1.2 Технологічний контроль після фільтру грубої очистки	Ступінь чистоти	Часточки бруду; манометр	Безперервно при подачі повітря	Е = 80 %
К2.1.3Технологічний контроль при стабілізації термодинамічних показників повітря	Температура	Темометр	Беспосердньо під час нагрівання	t = 200 ˚С W = 60 %
К2.1.4 Технологічний та мікробіологічний контроль стерильності повітря після тонкого очищення	Повітря, вміст мікроорганізмів та часток	Мікробна контамінаці; метод визначення (проба повітря КУО/м3) Седиментаційний (седиментація на пластинку КУО/м3)	Під час кожної зміни, під час виробничого біосинтезу	Не повинно бути життєздатних мікроорганізмів, та максимально допустиме число часток в 1м3 повітря 200. Е = 99,5%
К2.1.5 Технологічний і мікробіологгічний контроль повітря після очищення в індивідуальному фільтрі	Ступінь чистоти	Часточки бруду; манометр	Пезперервно при подачі повітря	Е = 99,999 % Не повинно бути життєздатних мікроорганізмів
К3.1. Технологічний контроль при приготуванні соляної кислоти	Концентрація соляної кислоти	Фізико-хімічний метод	Після приготування розчину	С = 6 %
К3.2. Технологічний контроль приготування розчину гідроксиду натрію	Концентрація гідроксиду натрію	Фізико-хімічний метод	Після приготування емульсії	С = 10 %
К3.3.Мікробіологічний та технологічний контроль стерилізації розчину гідроксиду натрію	Режим стерилізації розчину. Температура. Час Мікробна контамінація.	Технічний термометр годинник чашки Петрі	Температура визначаються безперервно під час стерилізації. Автоматичний регулятор температури Мікробіологічний метод, розведення та висів на МПА	t = 131˚С, τ =  30 хв Після стерилізації присутність м.о. не допускається.
К4.1.1 Мікробіологічний та технологічний контроль приготування та стерилізації розчину 1	Режим стерилізації розчину глюкози Температура Час Мікробна контамінація	Технічний термометр годинник чашки Петрі	Температура визначається безперервно  під час стерилізації. Автоматичний регулятор температури Мікробіологічний метод, розведення та висів на МПА	t = 112˚С, τ = 30 хв р = 0,5 атм Після стерилізації присутність м.о. не допускається.
К4.1.2 Мікробіологічний та технологічний контроль приготування та стерилізації розчину 2	Режим стерилізації розчину глюкози Температура Час Мікробна контамінація	Технічний термометр годинник чашки Петрі	Температура визначається безперервно  під час стерилізації. Автоматичний регулятор температури Мікробіологічний метод, розведення та висів на МПА	t = 131˚С,  τ = 40 хв p = 1,5 атм Після стерилізації присутність м.о. не допускається.
К5.2. Технологічний контроль приготування та стерилізації піногасника	Концентрація компонентів Температура Час	Термометр технічний  Годинник	Безперервно під час вирощування посівного матеріалу в ферментері	τ = 30 хв t= 120 °С КУО≤1
К6.1. Технологічний та мікробіологічний контроль вирощування посівного матеріалу в колбах на качалці (І генерації)	Температура Час рН Кількість обертів	Термометр технічний рН-метр Годинник	Під час вирощування посівного матеріалу в колбах	t = 37 °С pH = 6 τ = 48 год υ = 120 об/хв
К6.2. Технологічний та мікробіологічний контроль вирощування посівного матеріалу ІІ генерації.	Температура Час рН	рН-метр, Термометр Годинник	Під час вирощування посівного матеріалу в ферментері	рН =6, t = 2 доби, Т = 37 ˚С
К6.3. Технологічний та мікробіологічний контроль вирощування посівного матеріалу ІІІ генерації.	Температура Час рН	рН-метр, Термометр Годинник	Під час вирощування посівного матеріалу в ферментері	рН =6, τ = 42 год, t = 37 ˚С
К7.1. Технологічний та мікробіологічний контроль при виробничому культивуванні.	Температура Час рН	рН-метр, Термометр Годинник	Під час вирощування посівного матеріалу в ферментері	рН =6, τ = 5-6 діб, t = 37 ˚С Присутність сторонніх м.о. не допускається.

 

 

 

 

 

 

Методики визначення

1. Визначення концентрації цільового  продукту

Концентрацію  цільової речовини визначають методом  високоефективної рідинної хроматографії, оскільки це найбільш ефективний метод аналізу. Суть методу полягає в розділенні складних сумішей засновуючись на відмінності в рівноважному розподілі їх між двома фазами, що не змішуються, одна з яких нерухома, а інша рухома. Суміші нерівно розподіляються між двома фазами завдяки своїх полярності, розміру або іншим властивостям.

Культивування вважається успішним, якщо результати з визначення, концентрації цільового  продукту становитимуть 2,2 – 2,5 г/л.

2. Визначення концентрації біомаси

Концентрацію  біомаси визначаємо за оптичною густиною клітинної суспензії із наступним перерахунком на абсолютно суху біомасу у відповідності з калібрувальним графіком.

Культивування вважається успішним, якщо результати з визначення, концентрації біомаси  становитимуть 2 г/л.

3. Мікробіологічний контроль

В першу  чергу, перевірка чистоти культуральної  рідини проводиться з використанням  методу мікроскопіювання. Проте не завжди вдається отримати точні результати за даним аналізом. Тому наступною стадією є виділення ізольованих колоній на чашках Петрі з м'ясо-пептонним агаром та сусло-агаром.

Визначнення проводиться в стерильних умовах в боксі. Частота перевірки стерильності культуральної рідини приблизьмо кожних 5 годин.

4. Визначення концентрації джерела вуглецю

Суть  методу визначення концентрації джерела  вуглецю полягає в утворенні Cu(OH)₂, при змішуванні робочих розчинів Фелінга І та Фелінга ІІ, який легко відновлюється до вільної міді альдегідної групи глюкози. Мідь, яка виділяється, відновлює KI до вільного йоду, який відтитровують тіосульфатом натрію. Як індикатор використовується крохмаль [17].

Для культивування Acremonium chrysogenum використовується поживне середовище джерелом вуглецю в якому є глюкоза. Для визначення глюкози, в колбу піпеткою вноситься 5 – 9 мл розчину, що досліджується і доводиться дистильованою водою до загального об’єму 10 мл.

Із бюретки  додають по 10 мл розчину Фелінга  І і Фелінга ІІ. Колбу ставлять на плитку і кип’ятять протягом 2 хвилин. Після охолодження додають 15 – 20 мл 20 % сірчаної кислоти і 3 г йодистого калію. Йод, що виділився, титрують 0,1 н розчином тіосульфату. Коли розчин йоду починає світлішати, додають 2 – 3 краплини крохмалю і продовжують титрувати до зникнення синього забарвлення і виділення синього осаду. Кількість міді, яка пішла на реакцію з глюкозою, визначають за формулою [17]: