Молочнокислые бактерии: молочнокислые стрептококки(мезофильные,термофильные,ароматообразующие)

Молочнокислые стрептококки относятся к семейству Streptососсасеае, родам Lactococcus и Leuconostoc. К гомоферментативным относятся молочный (Lactococcus lactis) и сливочный (Lactococcus cremoris) стрептококки. Гетероферментативными являются ароматобразующие стрептококки, или цитроворусы, способные продуцировать ароматические вещества (диацетил, ацетоин) и усваивать соли лимонной кислоты — цитраты. В эту группу входят Lactococcus diacetylactis, Leuconostoc cremoris, Leuconostoc dextranicum

Промежуточное положение между гомо- и гетероферментативными стрептококками занимает термофильный стрептококк Str. thermophilus, поэтому его иногда называют среднегетерогенным видом. Молочнокислые стрептококки представляют собой шаровидные или овальные клетки размером до 1— 2 мкм в диаметре, располагающиеся в виде коротких цепочек или попарно; неподвижны, спор и капсул не образуют, по Граму красятся положительно В молодых культурах некоторые штаммы сливочного стрептококка образуют слизистую капсулу. Клетки ароматобразующих стрептококков несколько мельче, чем клетки Lactococcus lactis и Lactococcus cremoris, а клетки термофильного стрептококка крупнее, чем сливочного.

Молочнокислые стрептококки, так же как и палочки, по отношению к кислороду являются факультативными анаэробами, т. е. растут не только в анаэробных условиях, но и при доступе молекулярного кислорода. Однако в присутствии кислорода у них не изменяется тип дыхания, так как не проявляется аэробное дыхание, а продолжается процесс брожения. Поэтому молочнокислые бактерии можно отнести к категории аэротолерантных (воздухотерпимых) анаэробов.

Температурные границы жизнедеятельности этих микроорганизмов довольно широки. Для мезофильных видов оптимальная температура 25—30 °С, но имеются и термофилы, растущие при 38 — 43 °С. Минимальной температурой развития для мезофильных молочнокислых бактерий является 10 ° С, для термофилов — 20-22 °С. Имеются данные, что некоторые молочнокислые бактерии способны расти при очень низких плюсовых температурах (до 3 °С). По потребности в питательных веществах молочнокислые бактерии относятся к наиболее сложным микроорганизмам. В качестве источника углерода они могут использовать моно- и дисахариды, органические кислоты.

На обычных питательных средах они не развиваются, а растут на средах с добавлением аминокислот, гидролизатов белков мяса, лактальбумина, казеина, различных видов муки. Большинству видов молочнокислых бактерий необходимы аминокислот: аргинин, цистеин, глутаминовая кислота, лейцин, фенилаланин, триптофан, тирозин, валин. Только некоторые виды молочнокислых стрептококков могут расти на средах, содержащих аммонийные соли в качестве единственных источников азота,

Большинству молочнокислых бактерий необходимы витамины — рибофлавин (В2), тиамин (В1), пантотеновая (Вз), никотиновая (РР), фолиевая (Вс) кислоты, пиридоксин (В6) и др. Этим объясняется положительное влияние на рост микроорганизмов добавок к питательным средам различных питательных экстрактов (кукурузы, моркови, картофеля), дрожжевого автолизата и других витаминсодержащих соединений. Рост молочнокислых бактерий стимулируют и некоторые пептиды, пурины (аденин, гуанин, гипоксантин), пиримидины (урацил, тимин и др.), жирные кислоты (уксусная, олеиновая), а также лимонная кислота. Молочнокислые бактерии культивируют на обезжиренном стерильном молоке или на плотных и жидких искусственных питательных средах с использованием гидролизованного молока и других питательных веществ, получаемых из молока.

При развитии молочнокислых стрептококков в молоке они вызывают его свертывание (за исключением Leuconostoc demons), т. е. образование ровного, без обильного отделения сыворотки плотного сгустка, имеющего приятные кисломолочные вкус и запах. Ароматобразующие стрептококки образуют сгусток, в котором можно обнаружить в небольшом количестве пузырьки углекислого газа. На питательной среде (агар с гидролизованным молоком и мелом) молочнокислые стрептококки образуют мелкие (0,5—1 мм) каплевидные колонии с ровным краем, с зонами просветления мела. Колонии в толще пигательной среды (глубинные колонии) имеют форму лодочки или зерна чечевицы. Lactococcus diacetilactis на 3%-ном агаре; может образовывать глубинные колонии в виде паучков или комочков ваты, напоминающие колонии молочнокислых палочек.

Молочнокислые бактерии растут в средах с низким значением рН от 5,5 до 8,8, некоторые — при рН 2,9—3,2. Характерным свойством молочнокислых бактерий является высокая спиртоустойчивостъ. Они могут развиваться на питательных средах, содержащих 15—18 % этилового спирта, реже — при 24 %. Биохимические свойства молочнокислых бактерий изучают по энергии кислотообразования, предельной кислотности, способности сбраживать соли лимонной кислоты, по качеству сгустка, возможной протеолитической активности бактерий и др. Энергию кислотообразования определяют по времени образования сгустка молока (кислотность около 58—60 °Т) при внесении 0,5 см молодой (12—20-часовой) культуры в 10 см3 стерильного обезжиренного молока и выращивании посевов при оптимальной температуре.

Кислотность молока по Тернеру определяют титрованием децинормальным раствором едкого натра при индикаторе фенолфталеине, Для титрования берут 10 см3 молока, разбавленного 20 см3 воды (можно брать в 2 раза меньше). Объем щелочи (в см3 ), пошедшей на нейтрализацию кислоты, умножают на 10 (20) и получают таким образом кислотность молока (1 °Т соответствует 9 мг молочной, кислоты в 100 см3 молока).

Протеолитическую активность бактерий изучают на мясо-пептонной желатине, молоке или определяют с помощью специальных биохимических исследований и судят о ней по общему количеству образовавшихся водорастворимых продуктов распада белка, образовании аммиака, сероводорода, индола, которые характеризуют глубокий распад белковых веществ. Способность сбраживать соли лимонной кислоты (цитраты) определяют посевом бактерий на плотную среду с цитратом кальция. Появление зон просветления вокруг колоний свидетельствует об образовании водорастворимых продуктов брожения при наличии фермента цитритазы. Активность образования ароматических веществ устанавливают по количеству образовавшихся летучих соединений (методом возгонки) и четырехуглеродных соединений (диацетила и ацетоина).

Молочнокислые стрептококки обладают различной ферментативной активностью. Lactococcus lactis является активным кислотообразователем, Активные штаммы свертывают молоко за 4—7 ч, Предельная кислотность при его развитии достигает 120 °Т. Восстанавливает и свертывает лакмусовое молоко, не образует ацетоина, разлагает аргинин с образованием аммиака. Не развивается в среде, содержащей 6,5 % NaSi, и в щелочной среде при рН 9,5. Многие штаммы продуцируют антибиотик низин, который является полипептидом с молекулярной массой 3500. Он подавляет большинство стрептококков (но не энтерококков), стафилококков, микрококков, некоторые виды бацилл, лактобактерий, клостридий, актиномицетов. При этом в отношении грамотрицательных бактерий низин бактерицидным действием не обладает.

 

 

Рассмотрим три вида молочнокислых стрептококков:

1.мезофильные;

2.термофильные;

3.ароматообразующие.

 

4.Мезофильные  молочнокислые стрептококки.

К ним относятся Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris. Морфологические, культурные и ферментативные свойства этих микроорганизмов одинаковые.

Str. lactis (молочнокислый стрептококк) имеет клетки овальной формы, расположенные в виде коротких цепочек или соединенные попарно. Кроме моносахаридов, сбраживает лактозу и мальтозу. Оптимальная температура для развития 30—35°С.

При росте на поверхности твердых питательных сред образует мелкие, росинчатые колонии; глубинные колонии лодочкообразные или в форме чечевицы. Хорошо растут в присутствии глюкозы или лактозы. На гидролизованном агаре с мелом вокруг колоний образуют зоны просветления (в результате выделения молочной кислоты происходит растворение мела). Благоприятной средой для развития стрептококков является гидролизованное молоко. По росту на кровяном агаре относится к гамма-типу. Оптимальная температура роста 30°С. При этой температуре они свертывают молоко за 10—12 ч. Сгусток ровный, плотный, колющейся консистенции, имеет чистый кисломолочный вкус и аромат. Некоторые расы (разновидности) образуют сгусток тягучей консистенции и поэтому непригодны для выработки большинства кисломолочных продуктов. Str. lactis никогда не сбраживают рамнозу, сахарозу, раффинозу. Часто разлагают казеин. Предельная кислотность, создаваемая в молоке при культивдровании Str. lactis, колеблется в пределах НО— 120° Т (иногда 130° Т), однако встречаются и малоактивные штаммы, предельная кислотность которых достигает в молоке 90—100°Т.

Сквашенное молоко имеет ровный плотный сгусток и приятный кисловатый запах и вкус. Некоторые штаммы молочного стрептококка образуют сгусток вязкой, тягучей консистенции, поэтому непригодны для производства кисломолочных продуктов.

Некоторые разновидности Str. lactis продуцируют весьма активный антибиотик низин. Отдельные штаммы молочнокислых стрептококков могут вызывать пороки молочных продуктов: тягучесть, горечь (вследствие пептонизации молока) и др.

 

Str. cremoris (сливочный стрептококк). Он отличается от Str. lactis тем, что его клетки чаще располагаются в виде цепочек. Форма и величина колоний аналогична форме и величине колоний Str. lactis. Оптимальная температура развития Str. cremoris 20—25°С, максимальная 35—38°С. Через 12 ч в молоке образует прочный сгусток сметанообразной консистенции. Предельная кислотность, образуемая Str. cremoris в молоке, ПО—115°Т. Ферментативные свойства также идентичны. Str. cremoris отличается от Str. lactis по способности сбраживать мальтозу, декстрин, сахарозу. Str. cremoris не растет при 40°С в среде с 4% NaCl при рН 9,2. Str. cremoris не разлагает казеина, иногда и салицина.

В отличие от молочного стрептококка не сбраживает мальтозу и декстрин, лишен способности дезаминировать аргинин. Не растет на средах, содержащих 4 % КаС1, а также при температуре 39—40 °С.

Клетки в молоке часто бывают расположены в виде довольно длинных цепочек. Некоторые культуры сливочного стрептококка образуют в молоке сгустки сметанообразной консистенции. Сливочный стрептококк более чувствителен, чем молочный, к неблагоприятным условиям — он хуже развивается в весеннее время, а также в молоке, подвергнутом высокотемпературной обработке. Применяют сливочный стрептококк при производстве сметаны, творога, масла, сыров с низкой температурой второго нагревания.

Выделение чистых культур мезофильных молочнокислых стрептококков.

Источниками выделения

мезофильных молочнокислых стрептококков являются сырое молоко, оборудование, самоквасные кисломолочные продукты, а также растения, корни растений, иногда почва, расположенная в зоне корневой системы.

Для выделения

мезофильных молочнокислых стрептококков 1 г пробы растирают в стерильной ступке и готовят разведение 1 : 10 на физиологическом растворе. Полученную суспензию засевают в стерильное молоко (10 см3 в объеме 0,25-0,5 см3). Если культуру выделяют из кисломолочных продуктов, то одну каплю продукта вносят бактериологической петлей в стерильное молоко. Посевы термостатируют при 25-30°С до свертывания молока.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5.Термофильные молочнокислые стрептококки.

К ним относятся Streptococcus thermophilus.

Streptococcus thermophilus (термофильный стрептококк).. Термофильные стрептококки по сравнению с мезофильными лучше развиваются при повышенной температуре. Термофильные стрептококки в отличие от мезофильных сбраживают сахарозу. Поэтому для их выделения из посевного материала к безуглеводной питательной среде добавляют сахарозу. Форма и расположение клеток в мазках идентична морфологии и расположению клеток Str. cremoris. Клетки несколько крупнее, располагаются в виде цепочек разной длины. Но Str. thermophilus имеет и свои особенности (оптимальная температура развития 40—45°С, максимальная 45—50°С).

При росте на твердых питательных средах термофильный стрептококк образует округлой формы с зернистой структурой поверхностные и лодочкообразные, иногда с выростом, глубинные колонии.

 

Термофильный стрептококк отличается от мезофильных видов способностью сбраживать сахарозу, поэтому для его выделения к питательной среде, не содержащей углеводы, целесообразно добавлять сахарозу.

 

 

При оптимальной температуре развития термофильный стрептококк свертывает молоко около 12—14 ч, образуя ровный плотный сгусток со сметанообразной консистенцией. Вкус и аромат сквашенного молока приятные, кисломолочные; предельная кислотность равняется 110—115°Т. Некоторые расы термофильных стрептококков образуют диацетил; они являются ценными, так как в значительной степени улучшают качество продукта.

 

Культуры термофильных стрептококков целесообразно применять вместе с термофильными молочнокислыми палочками; при этом значительно смягчается вкус продукта (например, простокваши).

 

Термофильный стрептококк применяется вместе с болгарской палочкой при приготовлении южных простокваш (болгарской, мацони, мацуна). Кроме того, он играет важную роль при созревании сыров с высоким вторым нагреванием (швейцарский, советский).

 

Str. liquefaciens (Mammococcus) по ряду свойств — форме клеток и колоний, предельной кислотности — близок к Str. lactis. Оптимальная температура роста находится около 30° С; предельная кислотность, образуемая в молоке, равняется 110—115°Т. Помимо образования кислоты, маммококк обладает способностью выделять сычужный фермент. Вследствие одновременного воздействия на белки молока молочной кислоты и сычужного фермента образование сгустка наступает при пониженной кислотности (при 35—40 вместо 60° Т).

Некоторые штаммы стрептококка выделяют диацетил. Термофильный стрептококк не сбраживает мальтозы, декстрина и салицина; не разлагает казеина.

Выделение чистых культур термофильных стрептококков.

Процесс выделения чистых культур термофильных бактерий аналогичен процессу выделения мезофильных молочнокислых стрептококков. При этом термофильные молочнокислые стрептококки и палочки культивируют при 40-43 °С, за исключением ацидофильной палочки, которую выращивают при 37 °С. После проверки сгустка на типичность органолептических свойств и микрофлоры полученную обогащенную культуру, выращенную на стерильном молоке, высевают на плотную питательную среду (агар с гидролизованным молоком). Посевы термостатируют в течение 48 ч.

 

 

7.Ароматообразующие молочнокислые стрептококки.

В эту группу входят молочнокислые стрептококки, образующие в молоке и молочных продуктах повышенное количество летучих кислот (уксусной и пропионовой) и ароматических веществ (диацетил, эфиры). Большинство из этих бактерий имеет фермент цитритазу, вследствие чего они обладают способностью сбраживать лимонную кислоту; за эту способность их называют «цитроворусами». В настоящее время известны три вида ароматообразующих бактерий: Str. citrovorus, Str. paracitrovorus и Str. diacetilactis. Клетки их несколько мельче, чем у Str. lactis и Str. cremoris, и располагаются в виде отдельных клеток, диплококков и цепочек различной длины.