Микробиология

Определение чувствительности микроорганизма с помощью Е-теста проводится аналогично тестированию диско-диффузионным методом. Отличие состоит в том, что вместо диска с антибиотиком используют полоску Е-теста, содержащую градиент концентраций антибиотика от максимальной к минимальной . В месте пересечения эллипсовидной зоны подавления роста с полоской Е-теста получают значение минимальной подавляющей концентрации (МПК).

Несомненным достоинством диффузионных методов является простота тестирования и доступность выполнения в любой бактериологической лаборатории. Однако с учетом высокой стоимости Е-тестов для рутинной работы обычно используют диско-диффузионный метод.

Метод последовательных разведений антибиотиков. Готовят серию двукратных разведений антибиотика в жидкой или плотной питательной среде, а затем в пробирки или на поверхность чашек Петри с каждым из разведений засевают испытуемую культуру микробов.Методы разведения основаны на использовании двойных последовательных разведений концентраций антибиотика от максимальной к минимальной (например от 128 мкг/мл, 64 мкг/мл, и т.д. до 0,5 мкг/мл, 0,25 мкг/мл и 0,125 мкг/мл). При этом антибиотик в различных концентрациях вносят в жидкую питательную среду (бульон) или в агар. Затем бактериальную суспензию определенной плотности, соответствующую стандарту мутности 0,5 по MсFarland, помещают в бульон с антибиотиком или на поверхность агара в чашке. После инкубации в течение ночи при температуре 35о-37оС проводят учет полученных результатов. Наличие роста микроорганизма в бульоне (помутнение бульона) или на поверхности агара свидетельствует о том, что данная концентрация антибиотика недостаточна, чтобы подавить его жизнеспособность. По мере увеличения концентрации антибиотика рост микроорганизма ухудшается. Первую наименьшую концентрацию антибиотика (из серии последовательных разведений), где визуально не определяется бактериальный рост принято считать минимальной подавляющей концентрацией (МПК). Измеряется МПК в мг/л или мкг/мл (рис. 3).Минимальная подавляющая концентрация (МПК) - наименьшая концентрация антибиотика (мг/л или мкг/мл), которая in vitro полностью подавляет видимый рост бактерий.

14 Основные свойства бактериофагов

Химический состав фагов. Основными компонентами фагов являются белки и нуклеиновые  кислоты. Важно отметить, что фаги, как и другие вирусы, содержат только один тип нуклеиновой кислоты - ДНК или РНК и, в зависимости от типа нуклеиновой кислоты, их разделяют на ДНК-овые и РНК-овые. Нуклеиновая кислота находится в головке. Внутри головки фагов обнаружено также небольшое количество белка (около 3%). Содержание белков и нуклеиновых кислот у разных фагов варьирует. У некоторых их содержание почти одинаковое и каждый из компонентов составляет около 50%. У других фагов соотношение между этими основными компонентами может быть различно. Кроме указанных основных компонентов, фаги содержат в небольших количествах углеводы и, некоторые, преимущественно нейтральные жиры.

Морфология бактериофагов:

а.                    Фаги 1 типа; представлены ДНК-овыми нитевидными фагами, лизирующими бактерии, содержащие F-плазмиды.

б.                    Фаги 2 типа; представлены головкой и рудиментом хвоста. Геном большинства из них образован молекулой РНК и лишь у фага jc-174 — однонитевой ДНК.

в.                     Фаги 3 типа; имеют короткий хвост: например, Т-фаги 3 и 7.

г.                     Фаги 4 типа; включают фаги с несокращающимся хвостом и двухнитевой ДНК: например, Т-фаги 1 и 5.

д.                    Фаги 5 типа; представлены ДНК-выми вирусами с сокращающимся чехлом хвоста, который заканчивается  базальной пластиной: например, Т-фаги 2 или 4.

Строение бактериофагов наиболее полно охарактеризовано на основе изучения Т-фагов кишечной палочки

Головка Т-фагов образована из однотипных субъединиц, организованных по принципу кубической симметрии, и может достигать размеров 100 нм. Капсомеры головки состоят из белковых молекул, построенных преимущественно из аспарагиновой и глутаминовой кислот, а также лизина. Содержание белка и ДНК в головке примерно одинаково. Геном большинства фагов образует спирально упакованная двойная нить ДНК. Число фагов, содержащих одноцепочечную молекулу ДНК или РНК, незначительно. У некоторых фагов (например, Т2) в головке находится внутреннийбелок, содержащий полиамины (спермин и путресцин) и обеспечивающий суперспирализацию большой молекулы ДНК. В таком виде она может упаковываться в сравнительно небольшом объёме. В составе фаговой ДНК обнаружены необычные азотистые основания (например, оксиметилцитозин).

Хвост, или отросток, Т - фагов может достигать 250 нм в длину и 25 нм в ширину. Он включает полый стержень (сконструирован по принципу спиральной симметрии) и сократительный чехол, присоединяющийся к воротничку, окружающему стержень около головки. Чехол образован 120–140 белковыми молекулами, каждая из которых связывает одну молекулу АТФ и ионы Са2+. В дистальном отделе стержня расположена шестиугольная базальная пластина с шестью шипами и шестью нитями (фибриллами). У чётных фагов (например, у Т2) окончания фибрилл опущены вниз, а у нечётных - загнуты вверх. У некоторых Т-фагов в дистальной части хвоста находится лизоцим (эндолизин).

14 Взаимодействие вирулентного бактериофага с микробной клеткой.

Жизненный цикл фага начинается с прикрепления (адсорбции) фага на поверхностных фагоспецифических рецепторах клеточной стенки бактерий. Фаги с сокращающимися отростками адсорбируются с помощью хвоста. Внедрение фага внутрь клетки. Этот процесс происходит в результате сокращения хвостового чехла и проталкивания стержня сквозь оболочку бактериальной клетки, чему способствует фермент лизоцим, который располагается на конце хвостового отростка. После проникновения стержня в цитоплазму клетки открывается путь для перехода нуклеиновой кислоты из головки фага внутрь микробной клетки. Оболочка головки и отростки остаются снаружи клетки.

После проникновения нуклеиновой кислоты в цитоплазму клетки наступает эклипс — фаза, в течение которой не удается обнаружить фаговые частицы. В этот период в клетке разрушается бактериальная ДНК, прекращается производство бактериальных белков.

Репродукция фага. Начинается с синтеза ферментов, необходимых для создания фаговой нуклеиновой кислоты. Нуклеиновые кислоты фага в клетке появляются через 5 мин после ее заражения фагом. Через некоторое время происходит синтез структурных белков и других компонентов фага.

Формирование фага. Самая первая частичка, которую можно обнаружить в клетке при морфогенезе фага, — базальная пластинка. После базальной пластинки образуются стержень и чехол. Вначале на базальной пластинке монтируется стержень, а затем закрепляется чехол. К этому времени завершается формирование головки. Полностью сформированный хвостовой отросток присоединяется к головке и только после этого хвостовые нити могут прикрепляться к базальной пластинке.

15 Взаимодействие умеренного бактериофага с микробной клеткой

При изучении явления бактериофагии исследователи обратили внимание на то, что иногда встречаются культуры микроорганизмов, которые содержат фаги, хотя на               эти культуры фагами и не воздействовали. Другими словами, получалось, что вирулентных свойств фага оказывалось недостаточно для разрушения бактерий. Подобные вирусы, известные как умеренные бактериофаги, претерпевают любопытные превращения, известные как редукция фага. Умеренные фаги лизируют                        не все клетки в популяции, с частью из них они вступают в «симбиоз», в результате чего ДНК фага встраивается в хромосому бактерии. Геном бактериофага, пребывающий в таком состоянии называется профаг. Профаг, ставший частью хромосомы клетки, при ее размножении, реплицируется синхронно с геномом бактерии, не вызывая ее лизиса, а также передается по наследству от клетки к клетке неограниченному числу потомков. Биологическое явление симбиоза микробной клетки с умеренным фагом получило название лизогения, Это название (от греч. lysis, разложение, genea, происхождение) отражает способность профага самопроизвольно либо под действием ряда физических и химических факторов реактивироваться и запускать полный репродуктивный цикл, т.е. вести себя как литический бактериофаг. По своим основным свойствам лизогенные культуры принципиально не отличаются от исходных, но они невосприимчивы к повторному заражению гомологичным или близкородственным фагом и, кроме того, приобретают дополнительные свойства, контролируемые генами профага.

При размножении лизогенной культуры какая-то часть клеток популяции лизируется и освобождает зрелые частицы специфичного для этой популяции умеренного фага. Сохранение способности к инфицированию у умеренного фага зависит от низкомолекулярного белкового репрессора, кодируемого вирусной ДНК и «выключающего» все вирулентные функции бактериофага. Переход умеренного фага на литический цикл развития происходит              при нарушениях синтеза белкового репрессора. При этом встроенный в геном бактерии вирус проявляет все свои вирулентные свойства, репродуцируется и лизирует клетки, а также может инфицировать другие бактерии. Образование лизогенными культурами                 зрелых частиц фага получило название спонтанной индукции. Количество лизируемых клеток и количество образовавшихся  зрелых частиц фага зависят от особенностей данной культуры и условий выращивания. В то же время количество клеток, освобождающих фаги, может быть резко увеличено при    воздействии на лизогенную культуру некоторыми физическими и химическими факторами, или при создании в среде избытка некоторых питательных веществ и витаминов. При индукции некоторых лизогенных культур удавалось вызывать образование зрелых частиц фага почти у всех клеток. К индуцирующим агентам относятся ультрафиолетовые (УФ), рентгеновские и гамма-излучения, перекиси, азотистый иприт и его гомологи, этиленимин, урацил, многие антибиотики. Наиболее эффективные и широко применяемые индуцирующие факторы -  УФ-облучение и антибиотик митомицин С.

В отдельных случаях умеренный фаг лизогенной культуры может спонтанно (без внешних воздействий) или под влиянием различных факторов измениться и стать вирулентным. Тогда фаг приобретает способность лизировать все клетки данной культуры.

Другой источник:

Взаимодействие умеренного фага с бактериальной клеткой

Жизненный цикл фага начинается с прикрепления (адсорбции) фага на поверхностных фагоспецифических рецепторах клеточной стенки бактерий. Фаги с сокращающимися отростками адсорбируются с помощью хвоста. Внедрение фага внутрь клетки. Этот процесс происходит в результате сокращения хвостового чехла и проталкивания стержня сквозь оболочку бактериальной клетки, чему способствует фермент лизоцим, который располагается на конце хвостового отростка. После проникновения стержня в цитоплазму клетки открывается путь для перехода нуклеиновой кислоты из головки фага внутрь микробной клетки. Оболочка головки и отростки остаются снаружи клетки.

После проникновения нуклеиновой кислоты в цитоплазму клетки наступает эклипс — фаза, в течение которой не удается обнаружить фаговые частицы. В этот период в клетке разрушается бактериальная ДНК, прекращается производство бактериальных белков.

Репродукция фага. Начинается с синтеза ферментов, необходимых для создания фаговой нуклеиновой кислоты. Нуклеиновые кислоты фага в клетке появляются через 5 мин после ее заражения фагом. Через некоторое время происходит синтез структурных белков и других компонентов фага.

Формирование фага. Самая первая частичка, которую можно обнаружить в клетке при морфогенезе фага, — базальная пластинка. После базальной пластинки образуются стержень и чехол. Вначале на базальной пластинке монтируется стержень, а затем закрепляется чехол. К этому времени завершается формировние головки. Полностью сформированный хвостовой отросток присоединяется к головке и только после этого хвостовые нити могут прикрепляться к базальной пластинке.

16 Практическое применение бактериофагов (фагодифференцировка и  фаготипирование)

Фаготипирование помогает устанавливать источник инфекции, изучать эпидемиологические связи, отличать спорадические случаи заболеванийаотаэпидемических. 
В основе фагодиагностики и фаготипирования лежит принцип совместного культивирования выделенного микроорганизма с соответствующими видовыми или типовыми фагами. Положительным результатом считается наличие хорошо выраженного лизиса исследуемой культуры с видовым, а затем с одним из типовых фагов.

Фаготипирование. Для типирования бактерий суточную агаровую культуру испытуемого штамма засевают в 2,5 мл бульона Хоттингера или мясо-пептонного бульона (рН 7,2-7,4) и культивируют 3-4 часа при 37°С (до появления помутнения, видимого невооруженным глазом). Одновременно в чашки Петри заливают по 25-30 мл 1,2% агара на бульоне Хоттингера, дополненным внесением свежей мясной воды (рН 7,5±0,1), 0,4% глюкозы и CaCl2.  Хлористый кальций добавляют в расплавленный агар непосредственно перед разливом (из расчета 0,2 мл стерильного 10%-ного раствора CaCl2 на 100 мл агара). Чашки Петри, накрывают стерильными фильтрами и после застывания подсушивают 30-40 минут при 36-37 С. Затем чашки засевают исследуемой бульонной культурой с помощью пастеровской пипетки «газоном». Избыток культуры удаляют пипеткой. Открытую чашку с агаром накрывают стерильным фильтром и подсушивают 30-40 минут 36-37 °С.

Дно засеянной чашки расчерчивают маркером на 23 квадрата (по числу типовых бактериофагов) и в каждый квадрат засеянной чашки петлей диаметром, 2мм или тонко оттянутой пастеровской пипеткой наносят каплю соответствующего бактериофага всегда в одном и том же порядке

При нанесении бактериофагов следует избегать касания пипеткой поверхности агара во избежание возможности переноса культуры. После подсыхания капель бактериофагов чашку переворачивают крышкой вниз и инкубируют 18-20 часов при 30 °С, либо 5-6 часов при 36-37 °С с последующим культивированием течение 20-22 часов при комнатной температуре.

17 Практическое применение бактериофагов (фагодиагностика)

Фагодиагностика - метод идентификации выделенных культур микроорганизмов, основанный на способности диагностических фагов лизировать чувствительные бактерии. В основе фагодиагностики и фаготипирования лежит принцип         совместного культивирования выделенного микроорганизма с соответствующими видовыми или типовыми фагами. Положительным результатом считается наличие хорошо выраженного лизиса исследуемой культуры с видовым, а затем с одним из типовых фагов. Например, если лизис колоний вызван дизентерийным бактериофагом, то выделенные бактерии являются культурой шигелл. Строгая специфичность типовых фагов дает возможность идентифицировать отдельные варианты (фаговары) внутри вида. Таким образом обычно типируют золотистый  стафилококк и возбудитель брюшного тифа. Фаготипирование имеет большое значение в эпидемиологии, так как позволяет расшифровывать эпидемиологические цепочки, т.е. установить источник инфекции.

Оценка действия литических бактериофагов. На твёрдых средах в бактериальных культурах, засеянных сплошным «газоном», размножение фагов сопровождается лизисом бактерий и образованием зон просветления — «стерильных пятен». Для их обозначения предложен термин «негативные колонии бактериофага». У разных фагов они имеют строго определённые размеры и форму, например, звёздчатую у дизентерийных фагов). При заражении бульонных культур литическим фагом наблюдают просветление среды. Способность образовывать негативные колонии в культурах чувствительных бактерий широко применяют в качестве метода фагодиагностики при идентификации возбудителей инфекционных болезней.

На чашках Петри, засеянных исследуемыми культурами, бактериофаги образуют негативные колонии, что указывает на род и даже вид бактерии (в зависимости от специфичности фага). При распознавании неизвестных бактериофагов учитывают форму негативных колоний.

18 Практическое применение бактериофагов (фагопрофилактика и фаготерапия)

Фагопрофилактика - способ предупреждения развития заболеваний  в очагах инфекции посредством применения коммерческих препаратов бактериофагов.