Перекисное окисление белков плазмы крыс при экспериментальной гипоксии мозга крыс

ОГЛАВЛЕНИЕ
ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ				3
ВВЕДЕНИЕ				4
ГЛАВА 1. ОБЗОР  ЛИТЕРАТУРЫ				5
	1.1	Окислительный стресс		5
		1.1.1	Свободные радикалы	5
		1.1.2	Первичные радикалы	5
		1.1.3	Вторичные радикалы	5
		1.1.4	Активные формы кислорода	6
		1.1.5	Патология клетки при окислительном стрессе	9
ГЛАВА 2. МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ОРГАНИЗМЕ ПРИ  ГИПОКСИИ				15
ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ  СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ НА БЕЛКИ				18
ГЛАВА 4. АНТИОКСИДАНТНАЯ ЗАЩИТА КЛЕТОК				23
	4.1	Клеточные системы антирадикальной защиты		23
	4.2	Неферментативная антиоксидантная система		24
	4.3	Ферментное звено антиоксидантной  системы		28
ГЛАВА 5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ				30
	5.1	Подготовка материала  к исследованию		30
	5.2	Определение перекисного  окисления белков		30
		5.2.1	Реактивы для определения  ПОБ	30
		5.2.2	Ход определения ПОБ	31
	5.3	Определение степени  фрагментации окисленных белков		32
		5.3.1	Ход определения степени фрагментации окисленных белков	32
	5.4	Определение количества белка микробиуретовым методом		32
ГЛАВА 6. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ				34
ВЫВОДЫ				36
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК				37

 

 

 

 

 

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

 

АОС – антиоксидантная система

АФК – активные формы кислорода

ГР – глутатионредуктаза

СРО – свободнорадикальное окисление

СОД – супероксиддисмутаза

ПОЛ – перекисное окисление липидов

ПОБ – перекисное окисление белков

ОС – окислительный стресс

СФОБ-степень фрагментации окисленных белков

АТФ - аденозинтрифосфат

АДФ - аденозиндифосфат

АМФ - аденозинмонофосфат

Фн – фосфор неорганический

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ВВЕДЕНИЕ

На протяжении многих лет  одной из основных причин заболеваемости, инвалидности и смертности населения  в экономически развитых странах  и в Республике Беларусь являются сосудистые заболевания мозга. Смертность от расстройств мозгового кровообращения составляет 15% в общей структуре  смертности и в 3-4 раза превышает  смертность от инфаркта миокарда. До 70% всех нарушений мозгового кровообращения приходится на расстройства ишемического характера [1,2].

Высокий уровень смертности, отсутствие значительного прогресса  в профилактике и лечении расстройств мозгового кровообращения нацелили специалистов по нейробиологии на кардинальный пересмотр существующих классических представлений о патогенетических механизмах повреждения мозга при цереброваскулярных заболеваниях и призвал их направить все усилия на разработку новых, альтернативных путей лечения этой патологии.

В настоящее время большое  значение придается изучению состояния  свободнорадикальных процессов при нарушении мозгового кровообращения [3].

Свободные радикалы повреждают липиды, углеводы, нуклеиновые кислоты  и белки, что является причиной нарушения  функций клеток, вплоть до их гибели. Состояние перекисного окисления  липидов довольно подробно изучено, чего нельзя сказать о белках. Поэтому  целью работы является оценка роли окислительного стресса при развитии гипоксии мозга.

Достижение сформулированной выше цели планируется путем решения следующих задач:

1. Исследовать интенсивность процессов перекисного окисления белков в мозге крыс при экспериментальной гипоксии.
2. Определить степень фрагментации окисленных белков в мозге крыс при экспериментальной гипоксии.

Объектом исследований служит головной мозг крыс. Предметом исследований является изучение биохимических механизмов повреждения мозга гипоксией.

 

 

 

 

 

ГЛАВА 1

ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС

1.1 Свободные радикалы.

1.1.1 Первичные радикалы.

Первичные радикалы – образуются в процессе жизнедеятельности и  выполняют жизненно важные функции  переноса электрона в дыхательной  цепи (убихинон), защиты от микроорганизмов (супероксид) и регуляции кровяного давления (окись азота), радикалы ненасыщенных жирных кислот. Они образуются из молекул за счет реакций одноэлектронного окисления с участием металлов переменной валентности. Это компоненты дыхательной цепи, такие, как радикалы убихинона (коэнзим Q), супероксид и окись азота (NO).

В таблице 1.1 приведены первичные  свободные радикалы, образующиеся в  клетках организма.

Таблица 1.1-Первичные  радикалы 

Радикал	Основной источник	Вредные реакции
Семихиноны	Цепи переноса электронов	НQ + O2→Q+ O2-+ H+
Монооксид азота(NO)	Клетки эндотелия и  многие другие клетки	NO+O2-→OONO-(пероксинитрит)
Супероксид	Клетки-фагоциты	O2-+ Fe3+→ O2 +Fe2+

 

 

1.1.2 Вторичные радикалы.

Вторичные радикалы образуются также при действии ультрафиолетовых лучей и в ходе метаболизма  некоторых чужеродных соединений (ксенобиотиков), в том числе некоторых препаратов, одно время применявшихся в качестве лекарств. В таблице 1.2 представлены основные вторичные радикалы, образующиеся в клетках организма[10].

 

 

 

 

Таблица 1.2-Вторичные  радикалы 

Радикал	Основной источник	Вредные реакции
	H2O2 + Fe2+→ Fe3+ + HO- +HO`(реакция Фентона) HOC1 + Fe2+→Fe3+ + C1- + HO`(реакция Осипова)	Повреждение ДНК и РНК, цепное окисление липидов
Радикалы липидов	Цепное окисление липидов	Повреждение липидного бислоя и мембранных ферментов
Радикалы антиоксидантов	Цепное окисление липидов	Иногда оказывают прооксидантное действие
Радикалы, образующиеся при метаболизме ксенобиотиков	Промышленные токсины  и некоторые лекарства	Образование вторичных радикалов
Радикалы, образующиеся при  действии света	Поглощающие свет вещества	Образование вторичных радикалов

                                                                                                                                                             

1.1.3 Активные формы кислорода.

Существует в природе  некая субстанция, которая заставляет железо ржаветь, масло – становиться  прогорклым, а в человеческом организме  повреждает молекулы ДНК, ослабляет  память и ускоряет старение. Этим разрушителем является самый распространенный на Земле и в человеческом теле химический элемент-кислород. Без него человек  не может жить, но вместе с тем  иногда он превращается в грозную  опасность для здоровья. Каждый день мы дышим загрязненным воздухом, едим пищу с химикатами, пьем воду, содержащую десятки вредных веществ, ведем  жизнь, полную стрессов. Ученые установили, что в организме человека под  воздействием перечисленных выше факторов происходит образование так называемых ‹‹свободных радикалов››, которые  ответственны за ускоренное разрушение и деформацию клеток организма.

‹‹Парадокс кислорода››, как называют описанную ситуацию, связан со строением атома этого  газа. В обычном состоянии ядро атома кислорода окружено 8 электронами, которые объединяются в пары, образуя  устойчивую и не представляющую опасности  молекулу. Но порой под воздействием внешних факторов у молекулы отнимается или, наоборот, ей добавляется один электрон. Тогда рождаются исключительно  активные образования, получившие названия свободных радикалов. В качестве же внешних факторов, превращающих кислород из друга во врага, могут выступать и сигаретный дым, и городской смог, и ультрафиолетовое излучение[11].

Свободные радикалы, подобно  ‹‹молекулярным террористам››, ‹‹рыщут››  по живым клеткам организма, повергая все в хаос. Стремясь обрести нормальное количество электронов, они готовы ‹‹оторвать›› недостающую частицу  у любой повстречавшейся молекулы, вызывая цепную реакцию разрушений. Этот процесс, известный под названием  ‹‹окислительный стресс››, считается, ответственным и за множество  заболеваний – от катаракты и  потери мышечной массы до рака.

Свободный радикал образуется в момент, когда кислород, участвующий  в процессе метаболизма, теряет электрон. Пытаясь возместить потерю электрона, свободный радикал отбирает электрон, например, у молекулы, входящий в  состав клеточной мембраны, превращая  ее в новый свободный радикал. Эта цепная реакция ослабляет  клеточную мембрану, нарушает целостность  клетки и открывает дорогу многим дегенеративным заболеваниям.

Основная масса молекулярного  кислорода, потребляемого клетками нашего организма, непосредственно  восстанавливается до воды, окисляя  органические субстраты в цепях  переноса электронов. Меньшая часть  кислорода расходуется на неполное окисление органических соединений. Наконец, заметная часть кислорода  восстанавливается клетками нашего организма до супероксидного радикала. Дальнейшая судьба супероксидных радикалов может быть разной. В норме и при отсутствии ионов металлов переменной валентности супероксидные радикалы превращаются в перекись водорода.

Молекулярный кислород сам  по себе обычно не вступает в неконтролируемые химические реакции внутри организма, для его активации нужны ферментативные процессы – главные ферменты метаболизма  кислорода у млекопитающих: оксидазы и оксигеназы. Но в каталитических центрах этих ферментов кислород испытывает превращение до конечных соединений, не выделяясь в среду и не подвергая опасности органические макромолекулы клетки, повреждающими же агентами являются активные формы кислорода (АФК), образующиеся в ряде физико-химических процессов в организме. Главные активные формы кислорода:

• Супероксидные радикалы (O₂^-),
• Перекись водорода (H₂O₂),
• Гидроксильные (свободные) радикалы (^{`</sup>OH, HO<sub>2</sub><sup>`}),
• Синглетные формы кислорода (¹O₂),
• Ионы HO₂-.

 

Основные механизмы появления  АФК в организме связаны обычно с нарушениями функционирования электроннотранспортных цепей митохондрий или микросом, а также при изменении свойств дегидрогеназ. Особняком стоит нормальный процесс формирования АФК фагоцитами в ходе стимуляции неспецифической защиты организма[9].

Синглетный кислород образуется в реакциях фотоокисления,в присутствии так называемых фотосенсибилизаторов: флавины, гематопорфирин, хлорофилл и др., а также при дисмутации супероксидных радикалов. Синглетный кислород агрессивен в отношении биосубстратов, в особенности в отношении молекул с двойной связью; конечным итогом таких реакций обычно является образование гидроперекисей органических молекул – один из важнейших в процессах перекисного окисления ненасыщенных липидов в биомембранах.

В присутствии металлов переменной валентности эти продукты запускают  цепные реакции окислительной деградации биомолекул. Главным защитным механизмом такого процесса является бета-каротин, переводящий синглетный кислород в триплетный, однако, обычная вода и токоферол также способны вызывать такой процесс инактивации синглетного кислорода.