Перекисное окисление белков плазмы крыс при экспериментальной гипоксии мозга крыс

 

Антиоксиданты – большая  группа биологически активных соединений широко распространенных в природе. Спектр биологического действия антиоксидантов весьма разнообразен и обусловлен, в основном, их защитными функциями, выраженными в способности связывать  свободные радикалы (активные биомолекулы, разрушающие генетический аппарат клеток и структуру их мембран) и уменьшать интенсивность окислительных процессов в организме, таким образом – нейтрализовывать их негативное действие.

К числу наиболее известных  антиоксидантов относятся токоферолы и токотриенолы (витамин Е), каротиноиды (провитамин А) и витамин С.

Свойства антиоксидантов:

1 – замедляют процессы  старения и износа клеточных  мембран и самих клеток, а следовательно, и всего организма в целом;

2. – повышают устойчивость к действию радиации и других вредных факторов внешней среды;
3. – усиливают иммунитет;
4. – нормализуют функции сердечно – сосудистой и нервной систем;
5. – обладают антиканцерогенным действием[14].

 

4.2 Неферментативная антиоксидантная система

1. – Тиолдисульфидная система на основе глутатиона
• Аскорбатная  окислительно-восстановительная система.
• Ароматические соединения.
• Жирорастворимые АО:

• Витамины Е, А, К;

• Стероидные гормоны.
• Флавоноиды.
• Полифенолы (вит. Р, убихинон)

Витамин А. Это название обобщает несколько групп соединений: ретиноиды и каротиноиды. Различия между ними связаны, главным образом, с совершенно разными источниками поступления в организм и «местами их приложения».

Ретиноиды поступают в организм в основном с животной пищей и пресноводной рыбой. Они также содержатся в оптимальных количествах в яйцах и молочных продуктах. При этом чем больше продукты содержат жира, тем выше в них концентрация ретиноидов.

Ретиноиды играют исключительную роль в стимуляции роста и дифференцировки клеток ( как у эмбриона, так и у взрослого человека ), в развитии и функционировании костной и покровных тканей, а также обеспечивают нормальную работу зрительного анализатора: четкость, контрастность, цветовосприятие.

Одной из наиболее важных функций  ретиноидов является выраженная антиоксидантная активность. При этом активность в окислительно-восстановительных процессах во многом зависит от достаточности в организме цинка, железа и магния. Поэтому питание должно быть сбалансировано абсолютно по всем веществам.

При недостаточности ретиноидов повышается активность свободных радикалов, первым видимым результатом которой становится шелушение и сухость кожи. Позже к этому присоединяется и снижение зрения в вечернее и ночное время суток. При этом замедляется развитие и дифференцировка тканей будущего ребенка, нарушается нормальное функционирование плаценты, что может повлечь за собой задержку внутриутробного развития. В самых запущенных случаях, оставленных без коррекции врачами, А-витаминная недостаточность может привести даже к врожденной патологии – расщеплению верхнего неба плода.

В отличии от ретиноидов, каротиноиды поступают в организм с растительной пищей. Главным пищевым источником бетакаротина являются морковь, тыква, абрикосы ( и курага ), шпинат. Другими разновидностями каротиноидов богаты томаты, брокколи, сладкий перец и кабачки.

Сочетание продуктов, содержащих каротиноиды, с жирами значительно повышает их усвояемость. Вот почему рекомендуется, есть морковь со сметаной, тыквенную кашу на молоке и со сливочным маслом, салат из томатов и перцев заправлять 10%-ной сметаной. Для повышения доступности каротиноидов необходимо присутствие пищевых жиров. Наиболее эффективно доступность витамина А повышается в присутствии молочных жиров, поэтому и рекомендуются сметанные заправки, а не заправки из растительных масел. Можно сказать, что каротиноиды лучше усваиваются с растительным маслом, чем без него, но лучше со сметаной, чем с растительным маслом. Дефицит каротиноидов в организме проявляется только с одновременным дефицитом ретиноидов, так как эти соединения могут взаимозамещать друг друга в условиях дефицита одного из них. Как только запасы обоих видов соединений истощены, появляются признаки их недостатка, известные под общим названием «признаки дефицита витамина А».

Витамин Е. Самым популярным и универсальным антиоксидантом на сегодняшний день, бесспорно, является витамин Е, или токоферол. Механизм его защитного действия состоит в следующем. Токоферол встраивается в клеточную мембрану, таким образом, препятствуя атаке свободных радикалов и разрушению клеток. Он также самостоятельно связывает свободные радикалы, останавливая цепную реакцию окисления.

В последние годы появляются все новые данные о том, что, благодаря  своей антиоксидантной активности, витамин Е препятствует преждевременному старению, развитию атеросклероза и опухолевых процессов, а также нормализует дыхание на клеточном уровне.

Основными источниками токоферола являются растительные масла и продукты, содержащие их по природе ( семена, орехи, крупы ) или по рецептуре ( хлебобулочные изделия, макароны, майонез ). Наиболее богаты витамином Е рапсовое, хлопковое и соевое масла, а также миндаль ( однако не следует злоупотреблять орехами ввиду их высокого аллергенного потенциала ).

Дефицит витамина Е встречается крайне редко, ввиду его широкого распространения в продуктах питания, но во время беременности, когда повышается общий обмен веществ, могут наблюдаться признаки относительной Е-витаминной недостаточности. Они включают общую слабость, снижение мышечной силы, сухость кожи и некоторые другие неспецифические проявления.

Витамин С. По количеству одновременно выполняемых функций в организме витамин С является несомненным лидером. Во-первых, рассматривая его антиоксидантные качества, стоит отметить, что аскорбиновая кислота борется со свободными радикалами и перекисями напрямую, обеспечивая надежную защиту белков, жиров, ДНК и РНК ( генетического материала ) клетки. Она защищает от окисления жизненно важные клеточные ферменты, а также восстанавливает потерявший свою активность витамин Е. Во-вторых, витамин С отвечает за усвоение и обмен большинства витаминов и минеральных веществ. В-третьих, он участвует в синтезе коллагеновых волокон – основы соединительной ткани, норадреналина (гормона стресса, родственного адреналину) и серотонина (биологически активного вещества, контролирующего аппетит, сон, настроение и эмоции), желчных кислот и многих гормонов. В последние годы получены многочисленные подтверждения участия витамина С в поддержании нормального иммунитета.

Основными источниками витамина С являются продукты растительного происхождения. Особенно им богаты шиповник, сладкий перец, облепиха, черная смородина, зелень, картофель и капуста.

Для повышения доступности  витамина С необходимо помнить о следующих его особенностях. Наиболее насыщенны аскорбиновой кислотой периферические участки растений (листья зелени, кожура овощей и фруктов). Однако даже самая высокая концентрация витамина С может быть потеряна при кулинарной обработке, ввиду его особой нестойкости. Так, при варке супа теряется до 50%, а при жарении – до 90% аскорбиновой кислоты. Для предотвращения витаминных потерь существуют некоторые нюансы, которые должна учитывать будущая мама. Снизить кулинарные потери поможет варение овощей (например, картофеля) в кожуре. При этом овощи следует добавлять в уже кипящую воду и варить в кастрюле, закрытой крышкой. При дефиците аскорбиновой кислоты истончаются стенки сосудов, появляется кровоточивость десен, повышается ломкость капилляров, следствием чего может стать мелкоточечная сыпь на поверхности кожи. Сама кожа становится сухой, на ней появляются «пупырышки», именуемые «гусиной кожей». Подобное состояние сосудов характерно и для плаценты, в результате чего ухудшается кровоснабжение будущего ребенка.

Коэнзим Q-10, или убихинон, содержащийся в природных растительных маслах и орехах, является мощным антиоксидантом, препятствующим преждевременному старению, повышающим эластичность кожи и содержание влаги в клетках. Кроме того, Q-10 способствует восстановлению токоферола и увеличению жизненного потенциала клеток.

Ретинол, как сильнейший антиоксидант, препятствует воздействию на кожу ультрафиолетовых лучей, защищая ее от эффекта фотостарения.

Катехины (полифенолы) –  антиоксиданты, выделенные из экстрактов зеленого чая. Катехины блокируют действие радикалов, обладают противовоспалительным  и успокаивающим действием на кожу, используются в антивозрастных и солнцезащитных кремах.

Антоцианы - вещества, выделенные из виноградных косточек. Способны блокировать действие ферментов, активирующих свободные радикалы, а также, связывать и выводить из кожи токсины[12].

 

4.3 Ферментное звено антиоксидантной системы

К специфическим АО –  энзимам можно отнести супероксиддисмутазу, каталазу, глутатионзависимые пероксидазы и трансферазы.

Эта группа ферментов, локализующихся преимущественно внутриклеточно, обладает способностью разрушать свободные радикалы, а также участвовать в разложении гидроперекисей нерадикальным путем. Энзимы антирадикальной защиты характеризуются высокой избирательностью действия, направленного против определенных радикалов, специфичностью клеточной и органной локализации, а также использованием в качестве стабилизаторов металлов переменной валентности – меди, цинка, марганца, железа и др.

Супероксиддисмутаза (СОД) – ключевой фермент АО защиты; обеспечивает превращение супероксидного анион-радикала в менее активный окислитель – перекись водорода, которая элиминируется каталазой до двух молекул воды и молекулы кислорода. СОД содержит ион меди, ион цинка, ион железа и имидазол гистидина.

Основным местом локализации  фермента является цитозоль. СОД обладает высокой термоустойчивостью, устойчивостью к действию протеаз, денатурирующих агентов, широким оптимумом рН каталитической активности. СОД – водорастворимый фермент, поэтому супероксидный радикал, генерируемый в мембране и вызывающий процессы ПОЛ, оказывается для нее малодоступным.

Каталаза – обеспечивает расщепление перекиси водорода до 2-х молекул воды и кислорода; из-за большого молекулярного веса практически не проникает через клеточные мембраны.

Данные ферменты обладают слабой активностью по отношению  к липидным пероксидам, образующимся в ходе цепных реакций ПОЛ. Разрушение этих продуктов осуществляется с участием ферментной системы глутатиона.

Система ферментов глутатиона.

- селенсодержащая глутатионпероксидаза – локализована в цитозоле и митохондриях;

• Эффективно разлагает гидрофильные гидроперекиси липидов и перекись водорода;
• Катализирует реакцию восстановленного глутатиона с гидроперекисями липидов, при этом последние превращаются в жирные оксикислоты;
• Восстанавливает перекиси белкового и нуклеиновокислотного происхождения.

- глутатионтрансфераза – содержится преимущественно в цитозоле клеток; не взаимодействует с перекисью водорода.

• Восстанавливает гидрофобные гидропероксиды с большим объемом молекулы: гидроперекиси полиненасыщенных жирных кислот – линоленовой и арахидоновой, а также фосфолипидов;
• Восстанавливает гидроперекиси мононуклеотидов и ДНК, участвуя в их репарации.

- глутатионредуктаза – позволяет быстро пополнить пул восстановленного глутатиона, тем самым поддерживая нормальную работу глутатионзависимых ферментов[13].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ГЛАВА 5

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

 

5.1 Подготовка материала к исследованию

Опыты проводились на белых  беспородных крысах (самках) массой 220-250г. Всего в эксперименте использовали 30 животных, которые были распределены на 5 групп по 6 крыс в каждой : 1-я группа – контроль ( ложнооперированные, которым делали разрез кожи на шее; 2-перевязка общих сонных артерий на 1 час; 3-я - на 2 часа; 4-я – на 6 часов; 5-я – на 24 часа. В конце опыта животных умерщвляли путем мгновенной дислокации головы браншами мощных ножниц. Кровь собирали в гепаринизированные пробирки, затем центрифугировали с целью осаждения форменных элементов при 3000 об/мин 10 мин. Плазму переносили в пробирки Эппендорфа, замораживали в холодильнике при минус 10-15˚С и хранили до определения в них перекисного окисления белков, степени их фрагментации.

Перед определение пробы размораживали, плазму разводили физраствором 1:10.

5.2 Определение перекисного окисления белков

Перекисное  окисление  белков (ПОБ) определяли по методу, описанному в работе Вьюшиной А.В., Герасимовой И.Г., Флерова М.А.(18) Метод заключается в выявлении с помощью N-(2,4-Динитрофенил)-гидразина (С₆Н₅О₄N₄), модифицированных свободными радикалами белков.  В результате  при l=270нм регистрируются альдегидфенилгидразоны, а при l=363нм – кетондинитрофенилгидразоны.