Перекисное окисление белков плазмы крыс при экспериментальной гипоксии мозга крыс

Степень окислительной модификации белков выражали в еденицах оптической плотности на 1 мг белка. В работе использовали спектрофотометр СФ 46 фирмы ЛОМО (Россия).

5.2.1 Реактивы для определения ПОБ

1. N-(2,4-Динитрофенил)-гидразин (2,4-ДНФГ) – 0,01М раствор (198мг 2,4-ДНФГ+100мл 2н. HCl). Реактив может храниться при комнатной температуре в склянке из темного стекла несколько недель.
2. FeSO₄*7H₂O—0.01М раствор (готовить в день определения)
3. Этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) – 0,01М раствор. Можно хранить в холодильнике несколько месяцев.
4. Н₂О₂ – 1М раствор. Готовить из концентрированной Н₂О₂(примерно 34%) путём разбавления в дистиллированной воде(1мл Н₂О_2(к)+9млН₂О_(дис). Хранить в холодильнике.
5. Трихлоруксусная кислота – 20% раствор. Готовить из кристаллической ТХУК(20г ТХУК_(кр)+Н₂О_(дис) до 100мл). Хранить при комнатной температуре.
6. HCl – 2н. раствор. Готовить из НСl_(к) путём разбавления Н₂О_(дис). Необходимо измерить плотность(p)HCl_(к) для расчёта количества добавляемой воды.
7. Мочевина – 8М раствор. Приготовленный раствор использовать в течении недели. Хранить при комнатной температуре.
8. Смесь этанол и этилацетат 1:1; смешать поровну 96% этанол и этилацетат. Лучше использовать свежую смесь. Хранить при комнатной температуре.
9. Физиологический раствор NaCl – 0,9%. Приготовленный раствор можно хранить в холодильнике некоторое время.

5.2.2 Ход определения ПОБ

1. Перед определением, замороженную плазму разморозить при комнатной температуре и приготовить из нее разведение 1:10.
2. Для спонтанного ПОБ в чистые стеклянные пробирки добавить 0,95мл 0,015М калий-фосфатного буфера (рН=7,4).
3. Для стимулированного ПОБ в чистые стеклянные пробирки добавить 0,75мл 0,015М калий-фосфатного буфера(рН=7,4).
4. В обе пробирки  ( спонтанное и стимулированное) внести по 50 мкл плазмы 1:10, перемешать.
5. В пробирки для стимулированного ПОБ добавить 0,1мл свежеприготовленной смеси 1:1 10мМ FeSO₄  и 10мМ ЭДТА и +0,1мл 1М Н₂О₂. Перемешать. Таким образом, конечный объём проб для спонтанного и стимулированного ПОБ равен 1мл.
6. Обе пробы инкубировать 15 минут при t=37^oС на водяной бане.
7. После инкубации во все пробы добавить по 1мл 20% ТХУК и 1мл 0,01М 2,4-ДНФГ. Затем инкубировать при комнатной температуре 1 час.
8. Потом пробы перелить в пластмассовые центрифужные пробирки объёмом 5мл и центрифугировать 10 мин при 6000об/мин (центрифуга лабораторная настольная).
9. Надосадочную жидкость слить, осадок промыть 2мл смеси этанол-этилацетат. Особенно тщательно перемешивать стеклянной лопаточкой осадок на стенках центрифужных пробирок. Затем центрифугировать при тех же условиях.
10. Процедуру повторить ещё раз, то есть слить после центрифугирования надосадочную  жидкость, добавить 2мл смеси этанол-этилацетат, размешать стеклянной лопаточкой осадок и отцентрифугировать.
11. Осадок после 2-х кратной промывки подсушить феном или продувкой пробирки ртом.
12. К осадку белка в центрифужных пробирках добавить 3мл 8М мочевины и 1 каплю 2н. НСl, тщательно перемешать содержимое стеклянной лопаточкой. Затем содержимое из центрифужных пробирок перелить в чистые стеклянные и определить D_(опт) (оптическая плотность) образцов на спектрофотометре при l=270нм и l=363нм. Кювета кварцевая с длиной  оптического пути 10нм.

5.3 Определение степени фрагментации окисленных белков

Метод основан на принципе регистрации кислоторастворимых пептидов, подвергнутых действию свободных радикалов, которые обладают оптической плотностью в ультрафиолетовых спектрах при l=254нм, l=270нм, l=280нм.(19)

5.3.1 Ход определения степени фрагментации окисленных белков

1. В чистые стеклянные пробирки добавить 0,95мл 0,015М калий-фосфатного буфера, рН=7,4(это необходимо для спонтанного СФОБ).
2. В чистые стеклянные пробирки добавить 0,75мл 0,015М калий-фосфатного буфера, рН=7,4(это для стимулированного СФОБ); стимуляция средой Фентона (10мМ FeSO₄+10мМ ЭДТА в соотношении 1:1 и 1М Н₂О₂).
3. В обе пробирки добавить по 0,05мл плазмы, разведённой в соотношении 1:10 (как для ПОБ), перемешать содержимое пробирок.
4. В пробирку, где определяют стимулированное (иначе металл-катализируемое) СФОБ добавить 0,1мл свежеприготовленной (в день определения) смеси: 10мМ FeSO₄+10мМ ЭДТА и 0,1мл 1М Н₂О₂, перемешать и инкубировать на водяной бане 15 мин при температуре 25^оС.
5. Затем в обе пробирки (с спонтанным и стимулированным СФОБ) добавить 1мл 20% ТХУК, перемешать и инкубировать при комнатной температуре примерно 15мин.
6. Затем содержимое стеклянных пробирок перелить в центрифужные пластмассовые и центрифугировать 20мин при 3000g (на нашей центрифуге это 6000 об/мин).
7. Надосадочную жидкость слить в чистые пробирки, а осадок выбросить.
8. В чистые стеклянные пробирки добавить 2,5мл физраствора и 0,5мл надосадочной жидкости. Определить оптическую плотность при длине волн 254, 270 и 280 нм в кварцевой кювете с длиной оптического пути 10 нм.

5.4 Определение количества белка микробиуретовым методом(20)

Существует много методов  определения количества белка в  биологическом материале. Все они  отличаются по чувствительности. Мы взяли  для работы микробиуретовый метод. Он прост в исполнении и достаточен по чувствительности.

Реактивы:1.Биуретовый реактив для микроопределения (реактив Бенедикта).17,3 г цитрата натрия и 10 гNa₂CO₃ растворяют при подогревании в небольшом количестве воды. В раствор добавляют 1,73г сульфата меди, растворенного в 10мл воды и доводят водой до 100мл.

2. NaOH-6% раствор.

Ход определения: в стеклянные пробирки добавляют 2 мл H₂Odist.+0,05 мл плазмы 1:10 +2 мл 6% NaOH , встряхнуть +0,2 мл реактива Бенедикта, встряхнуть, инкубация при комнатной температуре не менее 15 мин. Затем измерить оптическую плотность проб при длине волны 330нм на спектрофотометре в кварцевой или полистироловой кювете с длиной оптического пути 10мм. Начинать измерения с контрольной пробы, которую готовить следующим образом: в стеклянную пробирку +2,05 мл H₂Odist.+2мл 6% NaOH+ 0,2 реактива Бенедикта.

Количество белка в пробах находили по колибровочному графику, построенному по стандартному раствору бычьего сывороточного альбумина.

Статистическая обработка  полученных данных.

Полученные данные подвергали ……………… методами вариационной статистике. Значимыми считали различия между  сравниваемыми группами при значениях  р<0,05.

ГЛАВА 6

РЕЗУЛЬТАТЫ  И  ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При ишемическом повреждении  мозга реализуется комплекс  патобиохимических и патобиофизических изменений, ведущих к формированию инфаркта мозга[21]. Даже кратковременная ишемия мозга часто ведет к глубоким повреждениям мозга вследствие отсутствия возможности полноценного энергообеспечения мозговой ткани за счет анаэробных процессов.

К настоящему времени изучены  основные звенья патогенеза ишемии. Результаты многочисленных исследований свидетельствуют о том, что гибель нервной ткани при ишемии мозга происходит в результате сложного каскада патофизиологических процессов, имеющих определенные временные и пространственные характеристики. При этом механизмы ауторегуляции становятся неадекватными и возникает ишемия нейроцитов при снижении артериального давления в сосудах головного мозга ниже 60мл ртутного столба. Экспериментальными исследованиями установлен алгоритм метаболических реакций ткани мозга на снижение мозгового кровотока[22]. При снижении уровня кровотока до 55 мл/100г/мин (первый критический уровень) возникает реакция в виде торможения белкового синтеза, снижение кровотока до 35мл/100г/мин (второй критический уровень) сопровождается активацией анаэробного гликолиза. Снижение кровотока до 20мл/100г/мин (третий критический уровень) приводит к формированию энергетической недостаточности и как следствие – к дисфункции каналов активного ионного транспорта, дестабилизации клеточных мембран и избыточному выбросу нейротрансмиттеров. Аноксическая деполяризация мембран и смерть клеток наступает при достижении уровня мозгового кровотока 10-15мл /100г/мин[21].

Рядом авторов показано, что на стадии ишемии в условиях ограничения кислорода в ткани  мозга происходит повышенное образование  перекисных продуктов[4,5.23].

Одним из источников образования  активных форм кислорода при ишемии является гипоксантин, образующийся при деградации АТФ и являющийся субстратом для ксантиноксидазы, содержание которой при ишемии возрастает.

Одним из возможных путей  генерации активных форм кислорода  при ишемии является метаболизм арахидоновой кислоты, образующейся из фосфолипидов в результате активации фосфолипазы. При ишемии мозга стимулируется образование индуцибельной изоформы циклооксигеназы , определяющей метаболизм арахидоновой кислоты, что приводит к повышенному образованию кислородных радикалов[21].

Важным источником активных форм кислорода при ишемии является мигрирующие в область ишемического повреждения фагоцитирующие клетки, а также обладающие фагоцитарной активности клетки глии и резидентные периваскулярные клетки[24]. В них, благодаря активации НАДФН₂ – оксидазы и миелопероксидазы, происходит наработка больших количеств активных форм кислорода[25]. В результате миграции фагоцитов в области ишемического повреждения нарабатываются огромные количества гипохлорит-аниона, который является сильным окислителем тиоловых соединений, липидов и NH₂ –групп белков, с которыми гипохлорит-анион образует хлораминовые комплексы. Таким образом, реакции воспаления играют важную роль в патогенезе церебральной ишемии[24].

Известно, что через активацию  наработки пероксинитрита глутамат также индуцирует образование гидроксильных радикалов[26]. Также обнаружена связь между образованием активных форм кислорода и поступлением в клетку кальция[27].

По данным [28] активные формы кислорода проявляют токсичность, индуцируют апоптоз и некроз клетки. Высокореакционноспособные радикалы кислорода вызывают окисление биомакромолекул (фосфолипидов, углеводов, аминокислот и нуклеиновых кислот), а также инициируют ценные процессы перекисного окисления в мембранных липидах нервных клеток[29].

Активация свободнорадикальных процессов также служит одним из механизмов повреждения митохондрий, которые сами являются важным источником кислородных радикалов, что сопровождается нарушением процессов электронного транспорта, продукции АТФ и дальнейшем нарастанием окислительного стресса- одного из важных механизмов гибели нервной ткани при ишемии мозга. В результате действия активных форм кислорода образуются сшивки биополимеров, происходит набухание митохондрий и разобщение окислительного фосфорилирования, инактивация тиоловых ферментов, участвующих в дыхании и гликолизе, дальнейшее разрушение липидной основы мембран[30]. Наличие большого количества липидов, высокие энергетические потребности делают мозг чувствительным к действию кислородных радикалов. Образующиеся при окислении свободных жирных кислот спирты, кетоны и альдегиды также повреждающе дейтвуют на цитоскелет, мембраны нейронов, повышая их проницаемость[30].

В наших экспериментах  мы попытались оценить выраженность окислительного стресса у крыс в  динамике развития экспериментальной гипоксии мозга. Для этого в плазме крови нами определено количество спонтанно окисленных белков и после стимуляции средой Фентона, а также спонтанную и металл-катализируемую фрагментацию окисленных белков.

Поскольку кровь является интегральной жидкостью организма, резонно было полагать, что патологические изменения в каком-то органе должны отражать на ее показателях.

В таблице 1,2 представлены данные по окислительной модификации белков плазмы крови крыс которым перевязывали общие сонные артерии на 1, 2, 6, и 24 часа. Видно, что на протяжении всех сроков наблюдения количество альдегидфенилгидрозонов (λ=270) и кетондинитрофенилгидрозонов (λ=363) существенно не отличается от контроля (ложнооперированные крысы). Нахождение отношения стимулированное/спонтанное ПОБ, характеризующее физиологические резервы антиоксидантной системы (таблица 6), также не вызвало статистически достоверных отклонений. Только через 2 часа ишемии наблюдалось снижение этого показателя на 8% (для альдегидфенилгидрозонов) и 9% (для кетондинитрофенилгидразонов).

Окислительная модификация  белков связана с изменением их структурной  организации, сопровождающейся фрагментацией  с образованием низкомолекулярных  компонентов, либо агрегацией белковых молекул[31]. Проведенный нами анализ надосадочной жидкости после осаждения белков (таблица 3-5) не выявил статистических значимых различий продуктов фрагментации окисленных протеинов плазмы крови, регистрируемых на длинах волн 254, 270 и 280нм у крыс с ишемией мозга. Однако через 1 час окклюзии общих сонных артерий наблюдалось 45%-ое увеличение продуктов спонтанной фрагментации, регистрируемых при λ=254нм и 28%-ое снижение продуктов модификации протеинов, регистрируемых при λ=270нм.

Таким образом, полученные нами данные по перекисному окислению  белков, их фрагментация в плазме крови  крыс в динамике развития экспериментальной  ишемии мозга указывают на признаки окислительного стресса.

Почему же кровь не показала заметных изменений в окислительной  деструкции белков? Это можно попытаться объяснить следующими моментами. Во-первых, возможно, что скорость снижения кровотока  в мозге в нашей экспериментальной  ситуации не была столь существенной. Известны три критических ее уровни[21].

Каждый из которых приводит к разной степени повреждения мозга. У крыс хорошо выражены компенсаторные механизмы нарушения кровообращения за счет позвоночных артерий. В этом отношении крысы являются неудобной моделью ишемии мозга, в отличие от монгольской песчанки (и людей), у которых компенсация кровоснабжения через вертебральные артерии весьма слабая. Во-вторых, операция перевязки общих сонных артерий, фиксация животных, сопровождается эмоционально-болевым стрессом, выработкой и “выбросом” в кровь больших количеств кортикостероидных гормонов из коры надпочечников. Кортикостероидные гормоны являются «ловушками» активных форм кислорода, т.е. выступает в роли антиоксидантов. В-третьих, не исключено, что в данной экспериментальной ситуации у животных активизировалось и ферментативное звено антиоксидантной системы,  которое на данных сроках ишемии успешно справлялось с повышенным уровнем свободных радикалов.