Перекисное окисление белков плазмы крыс при экспериментальной гипоксии мозга крыс

Во всех аэробных клетках  в процессе присоединения одного электрона к молекуле кислорода  образуются супероксидный анион-радикал – О₂^- и его протонированная форма – гидроперекисный радикал – НО₂^-; оба они порождают ряд других активных форм кислорода. Образование этих АФК наиболее существенно вблизи цепей переноса электронов – дыхательная цепь, микросомы и, в растительных клетках, хлоропласты. Дисмутация супероксидных анион-радикалов под действием СОД в биологических тканях ведет к образованию перекиси водорода, способной легко проникать через мембраны клеток.

Высокой реакционной способностью обладает гидроксильный радикал (^.ОН), образующийся из перекиси водорода в присутствии ионов переходных металлов. Высокая реакционная способность определяет преимущественно местное воздействие этой форм АФК. Прямое повреждение ДНК при этом характеризуется разрывом цепи; с другими биомолекулами ^.ОН образует вторичные свободные радикалы, в том числе перекисные соединения липидов.

Главные типы повреждений  биомолекул ^.ОН: отрыв атома водорода (таким образом повреждается лецитин – главный компонент биологических мембран, а также сахара в составе нуклеозидов ДНК); присоединения к молекулам по двойным связям (взаимодействие с пуринами и пиримидинами ДНК и РНК, в том числе с образованием вторичных радикалов); перенос электронов также является патогенным механизмом действия ^.ОН. В образовании гидроксильного радикала важное значение имеют ионы металлов с переменной валентностью, в первую очередь ионы железа.

Ионы железа входят в большом  количестве в состав организма (гемоглобин, миоглобин и пр.); в крови они  находятся в связанной форме  с трансферрином.

Снижение количества железа-переносящих  белков и повышение свободного железа крови может вести к стимулированию формирования свободных радикалов. Отмечено, однако, формирование гидроксильного радикала и под действием связанного железа – лактоферрина, а также при действии гемоглобина на перекись водорода.

АФК могут образовываться также и при многих иных процессах  в организме. Так, например, формирование АФК обычно сопровождает процесс  инактивирования в организме ксенобиотиков, потенцируя их повреждающий эффект[7].

 

1.2 Патология клетки  при окислительном стрессе

1.2.1 Строение клеточной стенки.

В трансмиссионном электронном  микроскопе она представляется трехслойной  структурой, состоящей из двух плотных  листков, каждый толщиной от 2 до 3 нм, разделенных менее плотным слоем, толщиной от 4 до 5 нм. Общая толщина мембраны составляет от 7,5 до 10 нм. Наружная поверхность ее представлена толстым слоем мукополисахаридов (гликокаликс). Внутренняя поверхность связана с элементами цитоскелета клетки и сформирована лабильными белками, которые обеспечивают целостность микрофиламентов и микротрубочек.

Средний слой мембраны состоит  из двух рядов молекул фосфолипидов, расположенных более или менее  перпендикулярно к поверхности  мембраны, так что их неполярные (гидрофобные) концы соприкасаются  друг с другом, а полярные (гидрофильные) обращены к водным раствором по ту или другую сторону мембраны.

Нормальная проницаемость  цитомембраны главное условие в гомеостазе клетки. При повреждении цитоплазматической мембраны нарушается её проницаемость, нарушается мембранный транспорт, коммуникации клеток и их "узнавание", изменения подвижности мембран и форма клеток, нарушения синтеза и обмена мембран, что проявляется в виде деформации или атрофии специализированных структур, появлением щелей или разрывов. Это приводит к быстрому набуханию клеток за счет поступления большого количества воды, распаду их цитоскелета. Меняется проницаемость мембраны для ионов натрия и калия и в клетке накапливается жидкость.

В каждой клетке нашего организма, каждое мгновение происходит с той  или иной скоростью бесконечные  процессы распада и синтеза, процессы восстановления и окисления различных  групп химических веществ. Среди  этих миллиардов химических превращений  происходит образование некоторых  химических веществ, которые по тем  или иным причинам не окислились или  не восстановились до конца. Эти вещества, состоящие из особых групп атомов или молекул, имеют очень высокую  реакционную способность, так как  содержат неспаренные (не прореагировавшие) электроны на внешних электронных уровнях. Эти группы атомов и молекул получили название свободные радикалы[11].

Свободные радикалы – очень  нестабильные частицы с нечетным числом электронов на внешней орбите, содержащие активированный кислород, вступающие в реакцию с липидами мембраны клетки (перекисное окисление  липидов) в результате которой происходит его разрушение, нарушается проницаемость, освобождается избыточная энергия, а все это в свою очередь  ведет к разрушению всей клетки.

Свободные радикалы образуются при воздействии неблагоприятных  факторов окружающей среды (загрязненная атмосфера, табачный дым, гипоксия у  больных с заболеваниями легочной системы; радиация, химические соединения, попадающие в организм с пищей  и т. д). такие молекулы стремятся отнять электрон у других полноценных молекул, вследствие чего пострадавшая молекула сама становится свободным радикалам, и таким образом, развивается разрушительная цепная реакция, губительно действующая на живую клетку человека.

Еще в 1954 году Доктор Денхам Харман, профессор в отставке университета Небраски, высказал идею о связи причины развития некоторых заболеваний с повреждающим действием свободных радикалов на организм человека. Спустя сорок лет эта теория стала ведущей, объясняя причины возникновения и развития более шестидесяти видов различных заболеваний.

К ним можно отнести  такие грозные болезни, как рак, атеросклероз, стресс, астма, артроз, варикозное расширение вен, болезни печени, почек, гипертензии, нарушение памяти, сахарный диабет и другие.

Дело в том, что свободные  радикалы повреждают клетки, которые  в результате этого теряют способность  к делению и выполнению своих  биологических функций.

Негативное действие свободных  радикалов проявляется в ускорении  старения организма, провоцировании воспалительных процессов в мышечных, соединительных и других тканях, неправильном функционировании различных систем организма: циркуляционной, нервной (включая клетки мозга) и иммунной систем. Эти нарушения связаны, прежде всего, с повреждением клеточных мембран[9].

 

1.2.2 Биомембраны

Биологические мембраны наряду с элементами цитоскелета формируют ультраструктуру протоплазмы. Кроме того, они выполняют множество функций, нарушение любой из которых может привести к изменению жизнедеятельности клетки в целом и даже к ее гибели.

Наиболее тяжелые последствия  вызывает повреждение липидного  слоя (или бислоя) мембран. Липидный слой клеточной и внутриклеточных мембран выполняет две основные функции – барьерную и матричную (структурную). Повреждение барьера приводит к нарушению регуляции внутриклеточных процессов и тяжелым расстройствам клеточных функций. С другой стороны, липидный слой мембран формирует в клетке особую жидкую фазу. На поверхности раздела водной и липидной фаз, а также внутри липидной фазы "плавают" многочисленные ферменты, многие субстраты биохимических реакций, белковые клеточные рецепторы, гликолипиды и гликолипопротеиды, образующие гликокаликс. Во многих клетках до 80% белков встроены в мембраны или связаны с их поверхностью. Липидный бислой выполняет, таким образом, роль структурной основы или матрицы для всех этих белковых, липопротеидных, гликопротеидных и гликолипидных компонентов мембран. От свойств липидной фазы мембран, таких, как вязкость, поверхностный заряд, полярность, зависит работа мембранных ферментов и рецепторов. Наличие гликокаликса характерно для наружных клеточных мембран. Он выполняет ряд функций, в частности, от него зависят свойства клеточной поверхности, способность клеток к фагоцитозу и адгезии с другими клетками. Гликокаликс эритроцитов препятствует их агглютинации. Повреждение гликокаликса приводит к тяжелым последствиям, помимо прочего еще и потому, что это приводит к изменению иммунных свойств клеточной поверхности. Действие многих токсических соединений направлено на белковые компоненты клеточной мембраны. Например, цианистый калий блокирует цитохромоксидазу – фермент, входящий в состав внутренних мембран митохондрий. Ионы тяжелых металлов (ртуть, серебро, свинец) связывают SH-группы белков, в том числе мембранных ферментов и ионных каналов, вызывая их инактивацию. На белки плазматических мембран или элементы цитоскелета направлено действие многих бактериальных токсинов. Изменения в активности мембранных ферментов, каналов и рецепторных белков, вызванные неблагоприятными факторами, также приводит к нарушению функции клеток и развитию заболеваний[6].

 

3. Основные механизмы нарушения барьерных свойств липидного слоя.

Изучение воздействия  разного рода повреждающих агентов  на изолированные клетки (например, эритроциты) показало, что, в конечном счете, существует всего четыре основных процесса, которые непосредственно  обусловливают нарушение целостного липидного бислоя в патологии:

1)перекисное окисление  липидов;

2)действие мембранных фосфолипаз;

3)механическое (осмотическое) растяжение мембраны;

4)адсорбция на бислое полиэлектролитов, включая некоторые белки и пептиды.

Перекисное окисление  липидов – пример процесса, идущего  с участием свободных радикалов. Свободные радикалы – это молекулярные частицы, имеющие непарный электрон на внешней орбитали и обладающие высокой реакционной способностью такой, что могут повреждать молекулы, которые являются важными для функции клеток. Эти вредные свободно-радикальные реакции также могут быть произведены различными факторами внешней среды.

Основные процессы, ведущие  к образованию свободных радикалов:

• Последовательное присоединение электронов к кислороду в присутствии металлов переменной валентности;
• Микросомальное и митохондриальное окисление, фагоцитоз;
• Ферментативные реакции с участием гидролаз, оксидаз, дегидрогеназ;
• Реакции автоокисления и биосинтеза (тиолы, катехоламины и т.д.);
• Окисление чужеродных соединений – ксенобиотиков, некоторых лекарственных препаратов;
• Действие негативных факторов среды (физические и химические инициаторы окисления);
• Фотохимические процессы;
• Перекисное окисление липидов;

Радикалы формируются  во внутренней митохондриальной мембране. Они могут вызывать цепные реакции в фосфолипидах, ведя к мембранному перекисному окислению липидов (ПОЛ) и нарушению двухслойной организации мембраны, которая является необходимой для мембраносвязанных ферментов и рецепторных функций. В условиях окислительного стресса, производится большое количество радикалов, превышающее возможности клеточной системы антиоксидантной защиты и приводящее к окислению полиненасыщенных жирных кислот в мембранных структурах. Перекисное окисление липидов также производит реактивные свободные радикалы и токсические альдегиды, которые могут полностью инактивировать ферменты и другие компоненты клеток[4].

 

4. Биологические последствия пероксидации липидов.

 

Увеличенное образование  свободных радикалов в организме  и связанное с этим усиление процессов  пероксидации липидов (которое иногда называют "оксидативным стрессом") сопровождается рядом нарушений в свойствах биологических мембран и функционирования клеток.

Наиболее важные изменения  в мембранных структурах при перекисном окислении липидов приведены  в таблице 1.3

 

Таблица 1.3- Изменения  в мембранных структурах при окислении  липидов.

Действие перекисного  окисления на мембранные белки	Действие перекисного  окисления на липидный слой мембран
Окисление тиоловых соединений	Увеличение микровязкости мембран
Повреждение переносчиков	Изменение поверхностного заряда мембран и липопротеинов
Появление проницаемости  для ионов	Уменьшение гидрофобного объема
Повреждение транспортных  АТФаз	Увеличение полярности липидной фазы
	Увеличение проницаемости  для ионов водорода
	Увеличение проницаемости  для ионов кальция

 

 

5. Окисление тиоловых групп мембранных белков.

Этот процесс может  приводить в результате к неферментативной реакции SH-групп со свободными радикалами липидов; при этом образуются сульфгидриальные радикалы, которые затем взаимодействуют с образованием дисульфидов либо окисляют кислородом с образованием производных сульфоновой кислоты.

Большую роль в патологии  клетки играет также инактивация ионтранспортных ферментов, в активный центр которых входит тиоловые группы, в первую очередь Са²⁺ -АТФазы. Инактивация этого фермента приводит к замедлению "откачивания" ионов кальция из клетки и, наоборот, к входу кальция в клетку, увеличению внутриклеточной концентрации ионов кальция и повреждению клетки. Наконец, окислению тиоловых групп мембранных белков приводит к появлению дефектов в липидном слое мембран клеток и митохондрий[8].Под действием разности электрических потенциалов на мембранах через такие поры в клетки входят ионы натрия, а в митохондрии – ионы калия. В результате происходит увеличение осмотического давления внутри клеток и митохондрий и их набухание. Это приводит к еще большему повреждению мембран: